田芳，阮群珈，石星，吳孟華，張英，曹暉，馬志國(guó)*

1.暨南大學(xué) 嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心，廣東 廣州 510632； 2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 嶺南資源分中心，廣東 廣州 510632； 3.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632； 4.烏魯木齊質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)研究院，新疆 烏魯木齊 830000

茵陳為菊科植物濱蒿ArtemisiascoparzaWaldst.et Kit.或茵陳蒿ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，春季采收的習(xí)稱“綿茵陳”，秋季采割的稱“花茵陳”。味苦、辛，性微寒，具有清利濕熱、利膽退黃的功能，臨床用于黃疸尿少、濕溫暑濕、濕瘡瘙癢[1]?！熬d茵陳”為臨床常用的飲片規(guī)格，其主要含有綠原酸、咖啡酸為代表的有機(jī)酸類(lèi)成分[2-3]，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部茵陳項(xiàng)下規(guī)定“綿茵陳”中含綠原酸不得少于0.5%。茵陳在中醫(yī)臨床上多以復(fù)方入藥，關(guān)于茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以茵陳飲片為對(duì)象，按照《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》的相關(guān)要求[4]，進(jìn)行茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究，以期為茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀(G7115A型DAD檢測(cè)器、G7129A型自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱、G7111A型在線真空脫氣機(jī))；FA 2204B 型萬(wàn)分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；EX225DZH十萬(wàn)分之一天平(美國(guó)奧豪斯儀器有限公司)；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)分別為：PRF7051143、PRF7041803、15020603、PRF7061112、15042210、15062011，純度均>98%)；對(duì)照品咖啡酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110885-200102，純度≥98%)；色譜純乙腈(上海麥克林生化科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水[華潤(rùn)怡寶飲料(中國(guó))有限公司]；其他試劑均為分析純。

本研究共收集市售15批茵陳飲片，所有飲片樣品經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院馬志國(guó)副教授鑒定為菊科植物茵陳ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，均為“綿茵陳”。15批茵陳樣品信息見(jiàn)表1。

表1 茵陳樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 茵陳飲片中綠原酸的含量測(cè)定

依照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部茵陳項(xiàng)下含量測(cè)定方法[1]，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)，柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm為色譜條件測(cè)定綠原酸的含量。結(jié)果有12批樣品的綠原酸含量符合《中華人民共和國(guó)藥典》限量標(biāo)準(zhǔn)要求，見(jiàn)表2。另存在3批不合格樣品。

2.2 茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

參考文獻(xiàn)[4]，將12批茵陳樣品制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取茵陳飲片100 g，加12倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁熱過(guò)濾，藥渣再加10倍量水回流提取20 min，趁熱過(guò)濾，合并2次濾液，濃縮至500 mL，搖勻，得生藥質(zhì)量濃度為0.2 g·mL-1的茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.3 茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸含量測(cè)定

供試品溶液的制備：取茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件、對(duì)照品溶液的制備及測(cè)定方法，參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部茵陳項(xiàng)下含量測(cè)定方法[1]，測(cè)定12批茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 轉(zhuǎn)移率、出膏率計(jì)算

以綠原酸為指標(biāo)成分，按公式(1)計(jì)算轉(zhuǎn)移率；取茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，搖勻，精密吸取50 mL置已恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量，按公式(2)得出膏率。見(jiàn)表2。

轉(zhuǎn)移率=茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分質(zhì)量/

飲片中指標(biāo)成分質(zhì)量×100%

(1)

出膏率=干膏質(zhì)量/(取樣量×標(biāo)準(zhǔn)湯劑生藥質(zhì)量濃度)×100%

(2)

表2 茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定 %

2.5 茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的建立

2.5.1色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～20 min，7%～15%B；20～30 min，15%～20%B；30～35 min，20%B；35～45 min，20%～25%B)，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2供試品溶液制備 茵陳飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液分別按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部茵陳項(xiàng)下和2.3項(xiàng)下方法制備。

2.5.3精密度試驗(yàn) 取同一批茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(YC-06)的供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸(3號(hào)峰) 為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為<0.20%、<1.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(YC-06)的供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、16 h 按2.5.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以綠原酸為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為<1.9%、<3.5%，表明茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(YC-06)的供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以綠原酸為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別<1.7%、<3.7%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5.6樣品檢測(cè)與分析 分別取12批茵陳飲片和飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄HPLC圖譜。將12批飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液的色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012A版)軟件，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.1，分別生成飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜(見(jiàn)圖1)，并生成各自的對(duì)照指紋圖譜(見(jiàn)圖2)，并以對(duì)照指紋圖譜為參照進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果茵陳飲片指紋圖譜中有7個(gè)共有峰，茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中有8個(gè)共有峰。12批茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑與共有模式對(duì)照指紋圖譜的相似度均高于0.96(見(jiàn)表3)。

2.5.7成分指認(rèn) 將已配制好的7種對(duì)照品溶液(綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩岷涂Х人?、茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，分別按2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，通過(guò)保留時(shí)間結(jié)合紫外光譜圖對(duì)供試品溶液各色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，見(jiàn)圖2。結(jié)果茵陳飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜中共指認(rèn)了7個(gè)共有峰，依次為新綠原酸(2號(hào)峰)、綠原酸(3號(hào)峰)、隱綠原酸(4號(hào)峰)、咖啡酸(5號(hào)峰)、1，3-二咖啡?？鼘幩?6號(hào)峰)、3，4-二咖啡酰奎寧酸(7號(hào)峰)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(8號(hào)峰)。1號(hào)峰未指認(rèn)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)[5-6]，可能為1-咖啡酰奎寧酸，有待于進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)。

注：A.茵陳飲片；B.標(biāo)準(zhǔn)湯劑；2.新綠原酸；3.綠原酸；4.隱綠原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡?？鼘幩幔?.3，4-二咖啡酰奎寧酸；8.4，5-二咖啡酰奎寧酸。圖1 12批茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

注：A.茵陳飲片；B.標(biāo)準(zhǔn)湯劑；2.新綠原酸；3.綠原酸；4.隱綠原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡酰奎寧酸；7.3，4-二咖啡?？鼘幩?；8.4，5-二咖啡?？鼘幩帷D2 茵陳飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜

表3 12批茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度

2.5.8飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的比較 通過(guò)比較12批茵陳飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的各共有峰的平均相對(duì)峰面積(見(jiàn)表4)，發(fā)現(xiàn)飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰中，除了8號(hào)峰，其他共有峰的相對(duì)峰面積差別較大。以3號(hào)峰(綠原酸)為參比峰，進(jìn)一步對(duì)比兩者的對(duì)照指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，除了8號(hào)峰，其他共有峰在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的相對(duì)峰高均高于飲片。

表4 12批茵陳飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的平均相對(duì)峰面積

3 討論

3.1 樣品來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)共收集了來(lái)自12個(gè)廠家的茵陳飲片15批，分別產(chǎn)于陜西、山東、甘肅、河南、山西5個(gè)產(chǎn)地。其中12批樣品中的綠原酸符合《中華人民共和國(guó)藥典》限量標(biāo)準(zhǔn)要求，另存在3批不合格樣品，編號(hào)為YC-13、YC-14、YC-15。因此，選取合格的12批茵陳飲片為研究對(duì)象進(jìn)行茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究。

3.2 供試品前處理及色譜條件優(yōu)選

在茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜供試品溶液制備方法的優(yōu)選過(guò)程中，以色譜峰峰形、分離度、分析時(shí)間等為指標(biāo)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑稀釋用溶劑的種類(lèi)和稀釋倍數(shù)進(jìn)行了考察。結(jié)果，稀釋用溶劑10%甲醇優(yōu)于無(wú)水乙醇；稀釋10倍為最佳稀釋倍數(shù)。故選取10%甲醇稀釋倍數(shù)10倍為茵陳飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液制備方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)選，采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液分別對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行液相色譜分離效果的考察，結(jié)果使用乙腈-0.1%甲酸可以使色譜峰達(dá)到更好的分離效果。同時(shí)考察了不同波長(zhǎng)(240、283、330 nm)下各活性成分的吸收情況，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)330 nm能兼顧大部分色譜峰的檢測(cè)，最終確定2.5.1項(xiàng)下的色譜條件。

3.3 飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的比較

茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中含有8個(gè)共有峰，其中7個(gè)共有峰亦為茵陳飲片指紋圖譜的共有峰。通過(guò)指認(rèn)，這些共有峰均為有機(jī)酸類(lèi)成分，且它們之間多為同分異構(gòu)體。文獻(xiàn)報(bào)道[7]，目前從植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸類(lèi)異構(gòu)體主要是單咖啡酰奎寧酸類(lèi)(綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸)和二咖啡酰奎寧酸類(lèi)(1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸和4，5-二咖啡?？鼘幩?；綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和鍵及多元酚3個(gè)不穩(wěn)定部分，前者易發(fā)生水解，后兩者易被氧化，綠原酸可通過(guò)水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化；若從酯鍵處斷裂，可產(chǎn)生奎寧酸和咖啡酰基的水解產(chǎn)物，咖啡酰基斷裂后在奎寧酸上的取代位置發(fā)生重排，可產(chǎn)生綠原酸的同分異構(gòu)體。針對(duì)茵陳飲片和湯劑兩者的指紋圖譜的共有峰的相對(duì)峰高差異較大這一現(xiàn)象，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，推測(cè)在煎煮過(guò)程中茵陳中的主要成分綠原酸(3號(hào)峰)和3，4-二咖啡?？鼘幩?7號(hào)峰)可能發(fā)生了水解和異構(gòu)化反應(yīng)而含量降低，使得相應(yīng)的異構(gòu)體：新綠原酸(2號(hào)峰)、隱綠原酸(4號(hào)峰)、1，3-二咖啡?？鼘幩?6號(hào)峰)、4，5-二咖啡?？鼘幩?8號(hào)峰)含量增加，從而造成兩者的指紋圖譜出現(xiàn)了差異。同時(shí)，綠原酸的轉(zhuǎn)移率為31.0%～62.4%，差異較大，平均轉(zhuǎn)移率僅為44.5%，也可能與煎煮過(guò)程中綠原酸的水解和轉(zhuǎn)化有關(guān)。因此，今后可對(duì)茵陳中有機(jī)酸類(lèi)成分煎煮過(guò)程中的分解轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行研究，指導(dǎo)其標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過(guò)程中工藝參數(shù)的優(yōu)選。在茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)控指標(biāo)方面也可增加新綠原酸、隱綠原酸等指標(biāo)成分，可更好地控制質(zhì)量。