張衛(wèi)飛 孫軍營 王方曦 李國慶 康斌 王德利 曾暉

（骨科生物材料國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東深圳 518036）

關(guān)節(jié)軟骨損傷是由于各種原因引起的關(guān)節(jié)透明軟骨的缺損，因關(guān)節(jié)軟骨缺乏淋巴和血管，因此自身的修復(fù)能力有限[1,2]。Curl等[3]回顧了31516例膝關(guān)節(jié)鏡檢查情況，發(fā)現(xiàn)63%患者存在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。正常關(guān)節(jié)面有透明軟骨覆蓋，一旦損傷透明軟骨，會(huì)引起關(guān)節(jié)的疼痛、不穩(wěn)和僵硬，加速關(guān)節(jié)退變，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4,5]。

人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）是一類具有強(qiáng)大的自我更新能力、多向分化潛能的細(xì)胞。近年來，隨著對(duì)hMSCs 和基因治療研究的不斷地深入，經(jīng)基因修飾的hMSCs 以良好的增殖能力、安全而可控的定向成軟骨細(xì)胞分化在軟骨損傷修復(fù)中展現(xiàn)出重要的價(jià)值和誘人的應(yīng)用前景[6-9]。

Kormish 等[10]發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路直接影響hMSCs 向軟骨細(xì)胞分化的過程，促進(jìn)hMSCs 的自我更新，抑制其向軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，而使其向成骨細(xì)胞分化的作用。Bi 等[11]在研究小鼠嵌合體模型時(shí)證實(shí)，Sox9基因敲除（Sox9-/-）的間充質(zhì)細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)不會(huì)表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性的Ⅱ型膠原α1 鏈基因（Col2αl）、Col9α2、Col11α2和ACAN，推斷Sox9是軟骨形成中最關(guān)鍵的基因。

因此，β-catenin基因抑制hMSCs 成軟骨分化，Sox9基因促進(jìn)hMSCs 成軟骨分化。但兩者聯(lián)合在hMSCs 早期成軟骨分化中的作用尚不明確。本研究擬通過將β-catenin基因敲減與Sox9基因過表達(dá)的腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）一起轉(zhuǎn)染進(jìn)hMSCs 成軟骨分化培養(yǎng)，與單獨(dú)的β-catenin基因敲減組及Sox9基因過表達(dá)組的成軟骨指標(biāo)進(jìn)行比較，探究β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合對(duì)hMSCs早期成軟骨分化的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

故本研究通過腺相關(guān)病毒將β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)轉(zhuǎn)染進(jìn)hMSCs，轉(zhuǎn)染24 h 后通過RTPCR檢測基因的轉(zhuǎn)染效率，之后成軟骨分化培養(yǎng)7 d，通過番紅固綠染色和甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨細(xì)胞基質(zhì)，通過RT-PCR 檢測COL2A1 和ACAN 的mRNA 表達(dá)量，通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測COL2A1和Aggrecan的蛋白表達(dá)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

實(shí)驗(yàn)材料、試劑包括骨髓來源hMSCs（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫），細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco 公司），胚牛血清（Gibco 公司），成軟骨分化培養(yǎng)基（賽業(yè)生物），Trizol（TaKaRa公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR 試劑盒（TaKaRa 公司），rAAV-β-catenin-RNAi 與rAAV-FLAG-Sox9（吉?jiǎng)P基因），熒光定量PCR引物[生工生物（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成]，anti-COL2A1抗體、anti-Aggrecan抗體（英國Cohesion公司）。

1.3 培養(yǎng)hMSCs及實(shí)驗(yàn)分組

首先將購買的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代，加入0.25%胰蛋白酶1 ml 消化細(xì)胞1 min，之后加入2 ml 的完全培養(yǎng)基中止消化，然后進(jìn)行2 min 的離心，速度1000 r/min，棄去上清液后加入3 ml的完全培養(yǎng)基，分裝到3個(gè)T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待長滿之后進(jìn)行第二次傳代，傳至第三代時(shí)細(xì)胞用來進(jìn)行成軟骨分化培養(yǎng)。將細(xì)胞消化后接種至六孔板，使六孔板的細(xì)胞密度在50%左右，加入2 ml成軟骨分化培養(yǎng)基，3 d換一次液，7 d后進(jìn)行下一步操作。

根據(jù)轉(zhuǎn)染的腺相關(guān)病毒不同分為4組：陰性對(duì)照組（empty vector），β-catenin基因敲減組（rAAV-βcatenin-RNAi），Sox9過表達(dá)組（rAAV-FLAG-Sox9），β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組（β-catenin-RNAi+rAAV-FLAG-Sox9）。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

收集需要進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)的細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用PrimerPrimer5 設(shè)計(jì)引物，根據(jù)目的基因選擇三步法進(jìn)行擴(kuò)增。完成循環(huán)數(shù)40 次，以肌動(dòng)蛋白β-actin 為內(nèi)參，根據(jù)熔解曲線判斷RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物序列見表1。

1.5 番紅固綠染色

在六孔板加入新鮮配制的Weigert 染液染色3～5 min，水洗，酸性分化液分化15 s，蒸餾水洗10 min，在固綠染色液內(nèi)浸染5 min，快速用弱酸溶液洗滌切片10～15 s，以便去除殘留的固綠。加入番紅浸染5 min，用PBS 洗3 遍，鏡下觀察，然后采用image pro plus 6軟件測定其平均吸光度值。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色

用20%的乙醇溶液稀釋甲苯胺藍(lán)染色液，稀釋至0.1%，六孔板加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，滴加稀釋后的甲苯胺藍(lán)染色液進(jìn)行滴染，加蓋玻片讓染料滲透到細(xì)胞中。將玻片豎起，稍加壓力，使多余染料被紙巾吸去。無需干燥，直接鏡檢后用image pro plus 6軟件測定其平均吸光度值。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)

在六孔板加入PBS 清洗細(xì)胞3次，每次1 min，之后4%多聚甲醛中固定30 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次，每次3 min，0.5%Triton X-100 通透細(xì)胞20 min，PBS 清洗細(xì)胞3次，每次3 min，3%過氧化氫處理15 min；PBS清洗細(xì)胞3 次，每次3min，用5%的BSA 封閉20 min，一抗孵育4℃過夜，PBS 清洗細(xì)胞3 次，每次3 min；二抗工作液孵育30 min（37℃），PBS清洗細(xì)胞3次，每次3 min；SABC 濕盒內(nèi)孵育在37℃下30 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次，每次3 min，DAB 顯色（避光，鏡下觀察至棕色）3～10 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次，每次3 min，鏡下觀察，之后用image pro plus 6 軟件測定其平均吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察骨髓來源hMSCs

在鏡下觀察骨髓來源hMSCs，第一代細(xì)胞呈長梭形、三角形。第三代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)基本均一，長梭形或扁平狀，呈典型密集旋渦狀、魚群樣排列、貼壁、增殖（圖1）。

2.2 RT-PCR檢測腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率

hMSCs 轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒24 h 后，收集細(xì)胞，檢測各組β-catenin和Sox9的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)β-catenin基因敲減組和聯(lián)合組β-catenin的mRNA 表達(dá)量顯著下降，而Sox9的mRNA 表達(dá)量增加。說明β-catenin基因敲減的效率較高，Sox9基因過表達(dá)成功（圖2）。

圖1 鏡下觀察骨髓來源人間充質(zhì)干細(xì)胞（200×）

圖2 轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒后各組β-catenin和Sox9的mRNA表達(dá)量

2.3 成軟骨分化后細(xì)胞番紅固綠染色

番紅固綠染色后發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組的平均吸光度為28.0±4.6，β-catenin基因敲減組為45.0±6.8，Sox9過表達(dá)組為69.0±2.4，β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組為120.0±5.5。聯(lián)合組的平均吸光度顯著高于其他三組（P＜0.05），由此可知聯(lián)合組蛋白多糖的含量高于其他三組（圖3）。

2.4 成軟骨分化后細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

甲苯胺藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組的平均吸光度為60.0±2.6，β-catenin基因敲減組為73.0±1.8，Sox9過表達(dá)組為97.0±8.3，聯(lián)合組為171.0±8.0。聯(lián)合組的平均吸光度顯著高于其他三組（P＜0.05），由此可知聯(lián)合組軟骨基質(zhì)的含量高于其他三組（圖4）。

2.5 成軟骨分化后軟骨指標(biāo)的mRNA表達(dá)

hMSCs 成軟骨分化7 d 后，檢測COL2A1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量：陰性對(duì)照組為0.99±0.16，βcatenin基因敲減組為1.89±0.18，Sox9過表達(dá)組為3.69±0.07，聯(lián)合組為5.21±0.10。4 組ACAN 的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.93±0.17、1.54±0.28、1.93±0.12、2.78±0.09。聯(lián)合組的COL2A1、ACAN 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于其他三組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 成軟骨分化后細(xì)胞COL2A1和Aggrecan的免疫組化

在六孔板中加入COL2A1 和Aggrecan 的一抗之后做免疫細(xì)胞化學(xué)。COL2A1的免疫組化中：陰性對(duì)照組的吸光度為8.0±1.5，β-catenin基因敲減組為35.0±3.2，Sox9過表達(dá)組為68.0±6.6，聯(lián)合組為121.0±7.2。在Aggrecan 的免疫組化中，上述各組的吸光度分別為9.0±2.7、21.0±4.2、58.0±8.4、100.0±6.4。COL2A1和Aggrecan 的免疫細(xì)胞化學(xué)中，聯(lián)合組的平均吸光度值高于其他三組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5，圖6）。

圖3 成軟骨分化后各組番紅固綠染色（200×）

圖4 人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化后各組甲苯胺藍(lán)染色（200×）

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨是滑膜關(guān)節(jié)重要的結(jié)構(gòu)和功能單位，主要由終末分化的軟骨細(xì)胞（占軟骨組織體積的5%～10%）和細(xì)胞外基質(zhì)（66%～78%的水、13%～18%的膠原和7%～10%的蛋白多糖）構(gòu)成，軟骨的功能包括傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤滑和抗磨損等[12]。由于關(guān)節(jié)軟骨自身特殊的解剖及組織學(xué)特點(diǎn)（如缺乏血管和淋巴管分布，缺乏修復(fù)損傷和缺損的未分化細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞包埋于致密的膠原/蛋白多糖基質(zhì)中而限制了細(xì)胞的增殖和遷移能力），導(dǎo)致其自我修復(fù)能力極其有限，一旦發(fā)生病損，受損關(guān)節(jié)往往發(fā)生不可逆的病理改變，并逐步惡化而最終進(jìn)展為骨關(guān)節(jié)炎（OA），大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)反復(fù)疼痛、行走困難、活動(dòng)受限，甚至殘疾等，嚴(yán)重影響正常的日?；顒?dòng)和生活質(zhì)量[13-15]。因此，通過人工方法修復(fù)軟骨損傷具有重要的臨床意義。

Wnt信號(hào)通路是在1973年Sharma發(fā)現(xiàn)的無翅基因（wingless）與1982 年Nusse 等發(fā)現(xiàn)的int-1基因的基礎(chǔ)上命名的重要信號(hào)通路[16]。已發(fā)現(xiàn)的Wnt 信號(hào)通路有兩個(gè)：依賴β-catenin（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路和非依賴β-catenin（Wnt/Ca2+和Wnt/Planar polarity）信號(hào)通路，其中以Wnt/β-catenin 信號(hào)通路最為經(jīng)典[17-19]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)出生后軟骨發(fā)生、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生成、軟骨內(nèi)成骨、骨重塑、骨折修復(fù)等多種生理與病理過程。此外，還對(duì)軟骨修復(fù)起重要的調(diào)控作用[20-22]。

人類Sox9基因是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因，位于17號(hào)染色體的長臂上，其翻譯的Sox9蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有位于羥基端HMG結(jié)構(gòu)域及位于氨基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，在除肥大的軟骨細(xì)胞外的所有軟骨前體細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)[23,24]。Bell等發(fā)現(xiàn)，Sox9能結(jié)合于Col2αl的軟骨細(xì)胞特異增強(qiáng)子，直接調(diào)控其表達(dá)；而與Sox9突變密切相關(guān)的骨骼發(fā)育異常綜合征的骨骼異常是由于在軟骨形成過程中Sox9對(duì)Col2αl異常調(diào)控造成的，認(rèn)為Col2αl是Sox9的靶基因[25,26]。

圖5 成軟骨分化后細(xì)胞COL2A1的免疫組化（200×）

圖6 成軟骨分化后細(xì)胞Aggrecan的免疫組化（200×）

Akiyama 等研究發(fā)現(xiàn)，Sox9可通過與核心轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 競爭性結(jié)合β-catenin而抑制β-catenin/TCF/LEF 的活性；同時(shí)，Sox9還可以通過與β-catenin結(jié)合后形成Sox9/β-catenin復(fù)合體而促進(jìn)其泛素/26S蛋白酶體途徑的降解[27]。Venkatesan 等[28]和Frisch等[29]均發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Sox9后將抑制hMSCs 的β-catenin表達(dá)；在體內(nèi)軟骨修復(fù)過程中也發(fā)現(xiàn)，Sox9過表達(dá)能抑制β-catenin的水平[30]。以上結(jié)果表明，在軟骨分化過程中，Sox9和β-catenin存在復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系。

鑒于Sox9與Wnt/β-catenin信號(hào)通路均在hMSCs成軟骨分化過程中起著重要作用，而兩者之間又存在著復(fù)雜而緊密的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，我們?cè)O(shè)想：能否通過增強(qiáng)Sox9表達(dá)的同時(shí)，調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活以促進(jìn)骨髓來源的hMSCs 更多、更安全和更穩(wěn)定地向我們期望的透明軟骨細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

本研究結(jié)果顯示，腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染后β-catenin基因的表達(dá)量下降，Sox9基因的表達(dá)量上升，提示基因敲減與過表達(dá)效率較高。番紅固綠染色顯示β-catenin敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組比其他三組紅色染色更深，提示β-catenin敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組蛋白多糖的含量比其他三組更高。甲苯胺藍(lán)染色顯示β-catenin敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組比其他三組藍(lán)色染色更深，說明聯(lián)合組的軟骨基質(zhì)更多。成軟骨分化后RT-PCR 結(jié)果顯示β-catenin敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組的COL2A1 和ACAN 的mRNA 表達(dá)量更高。另外，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示β-catenin敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合組棕色比其他三組更深，說明聯(lián)合組的COL2A1 和Aggrecan 蛋白表達(dá)量更高。以上結(jié)果說明，β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合對(duì)hMSCs早期成軟骨分化有促進(jìn)作用，為關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供了新的思路。

綜上所述，β-catenin基因敲減與Sox9過表達(dá)聯(lián)合對(duì)hMSCs 早期成軟骨分化具有促進(jìn)作用，能使骨髓來源的hMSCs 更多、更安全和更穩(wěn)定地向我們期望的透明軟骨細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，為關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供了新的思路。然而本研究沒有建立間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)微聚模型成軟骨球培養(yǎng)，需要進(jìn)一步探索。另外，本實(shí)驗(yàn)沒有建立動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞植入，這可以使得結(jié)果更具有說服力，需要在下一步實(shí)驗(yàn)中完善。