劉興國 劉 荔 王月玲 田妮娜

（蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050）

復(fù)方乳酶生散是胰酶與乳酶生組成的復(fù)方制劑，由乳酶生、胰酶和葡萄糖組成，治療消化不良、腹瀉、腹脹、小兒厭食等。其活性成分乳酶生為傳統(tǒng)的活菌素，具有微生態(tài)活菌制品的特性。雜菌是復(fù)方乳酶生散質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。中國藥典2015年版三部微生態(tài)活菌制品總論項下列出雜菌檢查法，但并沒有列出不同活菌制劑具體檢測雜菌的方法[1]。為了檢測復(fù)方乳酶生散的微生物限度，根據(jù)中國藥典非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法（四部附錄1105/1106）和微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法的要求，對復(fù)方乳酶生散雜菌檢查項目中的控制菌檢查、非致病性雜菌和真菌計數(shù)分別開展了適用性研究，建立了復(fù)方乳酶生散雜菌檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器：梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 菌株：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、痢疾志賀菌[CMCC（B）51252]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），營養(yǎng)瓊脂，玫瑰紅鈉，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限提供。7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基NAC液體培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基由青島海博生物技術(shù)有限公司提供。以上培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

1.4 樣品：復(fù)方乳酶生散（醫(yī)院制劑，批號：12011，12012，12013，活菌含量5×108cfu/g）。

2 結(jié)果

2.1 菌液制備：將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、痢疾志賀菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30～35 ℃，培養(yǎng)時間18～24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDB）中，培養(yǎng)溫度20～25 ℃，白色念珠菌培養(yǎng)時間為2～3 d。每種新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液，備用。

2.2 供試品的處理：稱取本品1 g，加到9 ml0.9%無菌氯化鈉溶液制成1∶10供試液[1]。

2.3 非致病性雜菌、真菌計數(shù)方法適用性試驗：①試驗組：取1∶10供試液4份，分別加入制備好的菌懸液0.1 mL，混勻，使0.1 mL供試液中含菌量含菌數(shù)50～100 cfu。非致病性雜菌：取供試液0.1 mL，加到已備好的磷酸鹽緩沖液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[每1000 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，加人磷酸二氫鉀3.56 g、磷酸氫二鈉7.23 g，溶解，混勻，分裝，121 ℃濕熱滅菌20 min上]，以L形涂布棒涂勻，一式3份，倒置，置30～37 ℃培養(yǎng)，在48 h內(nèi)觀察結(jié)果[1]。真菌：取供試液0.1 mL，加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基基上，以L形涂布棒涂勻，一式3份，倒置，置20～28 ℃培養(yǎng)，在96 h內(nèi)觀察結(jié)果[1]。②供試品對照組：測定供試品的含菌量。③菌液對照組：測定每一菌株的試驗菌數(shù)。見表1。

2.4 控制菌檢查方法驗證

2.4.1 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗：取供試品lg，加到9 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中制成1∶10的勻液，加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，混勻，培養(yǎng)18 h，取上述培養(yǎng)物0.1 mL滴加到曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平皿上，以L形涂布棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)18 h，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平皿呈紫黑色帶有金屬光澤的典型菌落。陰性對照組及供試品對照組均無菌落生長。

表1 非致病性雜菌、真菌計數(shù)試驗結(jié)果

2.4.2 志賀菌、沙門菌檢查方法適用性試驗：取供試品l g，加到9 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中制成1∶10的勻液，制備兩份，分別加入不大于100 cfu的痢疾志賀菌、乙型副傷寒沙門菌，混勻，培養(yǎng)18 h，取上述培養(yǎng)物0.1 mL滴加到沙門、志賀菌屬瓊脂平皿上，以L形涂布棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)24 h，乙型副傷寒沙門菌在沙門、志賀菌屬瓊脂平皿呈無色透明、中心呈黑褐色的菌落。痢疾志賀菌在沙門、志賀菌屬瓊脂平皿呈無色、半透明、微凸、光滑的菌落。陰性對照組及供試品對照組均無菌落生長。

2.4.3 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗：取供試品1 g，加到9 mL NAC液體培養(yǎng)基中制成1∶10的勻液，加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌，混勻，培養(yǎng)18 h，取上述培養(yǎng)物0.1 mL滴加到NAC瓊脂平皿上，以L形涂布棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)18 h，NAC瓊脂平皿呈產(chǎn)綠色色素的菌落。陰性對照組及供試品對照組均無菌落生長。

2.4.4 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗：取供試品1 g，加到9 mL 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中制成1∶10的勻液，加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌，混勻，培養(yǎng)18 h，取上述培養(yǎng)物0.1 mL滴加到甘露醇氯化鈉瓊脂平皿上，以L形涂布棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)18 h，甘露醇氯化鈉瓊脂平皿呈金黃色菌落。陰性對照組及供試品對照組均無菌落生長。

3 討論

3.1 微生態(tài)制劑雜菌含量檢測常用的方法為顯微鏡檢法和微生物學(xué)檢驗法。顯微鏡檢法無法確切區(qū)分活菌、死菌和雜菌，只能大致了解微生物的數(shù)量；微生物學(xué)檢驗法主要通過平板法進(jìn)行計數(shù)[2]。中國藥典2015年版雜菌檢查法采用涂布法進(jìn)行檢測。本實驗控制菌檢查和真菌計數(shù)將供試液涂布于選擇性培養(yǎng)基平板的方法對復(fù)方乳酶生散進(jìn)行適用性檢查，結(jié)果滿足要求。由于樣品中含活菌數(shù)高達(dá)5×108cfu/g以上，非致病性雜菌的菌落數(shù)限度僅為樣品的1/500000（中國藥典規(guī)定口服微生態(tài)活菌制品成品的非致病性雜菌數(shù)不得超過1000 cfu/g）[3]，在非選擇性平板上巨量的活菌會掩蓋雜菌，使菌落計數(shù)非常困難，主要由于大量活菌產(chǎn)生乳酸改變培養(yǎng)基酸堿度，從而抑制雜菌的生長，因此為了增加培養(yǎng)基緩沖能力，使其pH值保持相對穩(wěn)定，試驗中改用磷酸緩沖液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，有效降低活菌對雜菌檢查的干擾[4]。

3.2 雜菌檢查法要求進(jìn)行控制菌、非致病性雜菌總數(shù)及真菌數(shù)檢查。復(fù)方乳酶生散采用常規(guī)方法均能滿足方法適用性要求。

3.3 復(fù)方乳酶生散為醫(yī)院制劑，歸屬生化藥品管理，在執(zhí)行微生物限度檢查時，一般會出現(xiàn)活菌和雜菌之間相互干擾的情況，結(jié)果判斷困難。本研究改良培養(yǎng)基的緩沖能力，有效降低了活菌的干擾。