胡躍強(qiáng)，陳 煒，祝美珍，梁 妮，吳 林，唐 農(nóng)△

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (南寧 530023)；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)(南寧 530001)

最近的研究結(jié)果提示，自噬在腦缺血再灌注損傷(Ischemia/reperfusion,I/R)過程中發(fā)揮重要的作用。在自噬過程中，自噬因子如LC3、P62調(diào)節(jié)自噬的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，近年來受到廣泛的關(guān)注[1]。P62與LC3的直接作用招募自噬體降解聚集蛋白并引起自噬激活[2]，但其在腦I/R損傷中的信號(hào)調(diào)控機(jī)制鮮見。清熱化瘀方是治療腦梗死有較好療效的中藥復(fù)方制劑[3]，前期研究證實(shí)其有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激的作用，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬密切相關(guān)[4]，因此我們?cè)噲D探討本方可能通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究即是通過探討該方對(duì)P62和LC3表達(dá)的影響，以進(jìn)一步闡明其抗腦缺血損傷的機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物制備：①清熱化瘀方：由水牛角、生牡蠣各30 g，丹參、赤芍各15 g，地龍、石菖蒲、郁金、川芎、天竺黃各10 g，酒大黃6 g等藥物組成，單味中藥濃縮顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)：0904099)。②清開靈顆粒：由哈爾濱一洲制藥廠制備(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930010)。

1.2 動(dòng)物分組及動(dòng)物飼養(yǎng)：雄性SD大鼠160只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g(合格證號(hào)：SCXK2016-0002)。將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:即假手術(shù)組(Sham-operation，SO)、模型組(Ischemia/reperfusion,I/R)、清熱化瘀顆粒組(Qingre Huayu,QRHY)和清開靈顆粒對(duì)照組(Qingkailing,QKL)。每組按再灌注后處死的時(shí)間點(diǎn)再分為12 h、1 d、2 d、3 d 四個(gè)亞組(n=10)。各組大鼠分別作如下處理：SO 組：以假手術(shù)代替缺血再灌注；I/R組：動(dòng)物行大腦中動(dòng)脈梗阻 2 h，再灌注后規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死；造模后灌胃等體積的生理鹽水；QRHY 組:在制作大鼠模型前 30 min予以QRHY顆粒溶液灌胃14 g/(kg·d)，在造模麻醉清醒后 1 h 繼予該顆粒灌胃，每天上、下午各 1 次；QKL 對(duì)照組：在制作大鼠模型前 30 min予以QKL顆粒溶液灌胃 20 g/(kg·d)，在造模麻醉清醒后 1 h 繼予該顆粒灌胃，每天上、下午各 1 次。動(dòng)物灌胃濃度及等效劑量按人和動(dòng)物間體表面積比值表折算獲得。

1.3 主要試劑：總RNA 提取試劑盒(北京天根公司)；PCR反應(yīng)試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Trizol reagent(日本Takara)；引物及內(nèi)參(桂林恒順公司)；小鼠抗大鼠 P62及兔抗LC3單克隆抗體(英國(guó)Abcam)；羊抗小鼠或兔 IgG二抗(北京中杉公司)。

1.4 造模方式：采用Longa’s法并加以改良。大鼠術(shù)后2 h將尼龍線輕輕拔退約2 cm，此時(shí)記為再灌注0 h，假手術(shù)插線深度為9 mm。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，進(jìn)食顆粒食物。取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血及提前死亡的大鼠予以剔除。

2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

2.1 電子透射顯微鏡觀察：神經(jīng)元自噬及形態(tài)學(xué)改變將大鼠右側(cè)海馬分離，切割成約1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛溶液中。0.01 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，后固定于1%鋨酸緩沖液中2h，再予50%丙酮脫水10 min、浸透，然后包埋、切片及檸檬酸鉛與醋酸鈾雙重染色染色。最后H-600型透射電子顯微鏡(日本日立)攝片觀察。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)：P62和LC3 mRNA表達(dá)變化①按TRIzol提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA；②目的基因引物序列： P62：上游引物5’- ACCCATCCACAGGTGAA CTC-3’；下游引物 5’-GTGGG AGATGTGGGTACAGG-3’；LC3：上游引物5’-GCAGCCT GGATGTTCAGAAT-3’，下游引物 5’- TGGATTGCCTGAGACTCCTT-3’；β-actin：上游引物TGTCACCAA CTGGGA CGATA；下游引物GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA；③反應(yīng)條件：反應(yīng)體系均為10 μl，在 DNA Engine Opticon TM 2 連續(xù)熒光檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：96 ℃ 4 min，然后3步反應(yīng)：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，第3步72 ℃ 30 s收集熒光信號(hào)，同時(shí)擴(kuò)增β-actin做內(nèi)參照。⑤結(jié)果處理：ΔΔCT法：A=CT(目的基因)-CT(內(nèi)標(biāo)基因)，B=CT(目的基因)-CT(內(nèi)標(biāo)基因)，K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。ΔCT值與mRNA表達(dá)量成反比，即ΔCT值越小，表明mRNA表達(dá)量越多。

3 Western blot檢測(cè)P62和LC3蛋白表達(dá)測(cè)定①標(biāo)本的制備：在SDS上樣緩沖液中裂解大鼠缺血半暗帶組織； ②SDS-PAGE電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE；③轉(zhuǎn)膜：恒流1 mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5 h。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰。④雜交：用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。加入稀釋好的鼠抗P62和LC3一抗，4℃ 放置12 h以上。然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫2 h。最后加入顯色液。⑤檢測(cè)：增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(ECL)。⑥結(jié)果處理：獲取各組免疫印跡條帶的平均吸光度(A)值，內(nèi)參為β-actin，目的蛋白的相對(duì)值=目的蛋白/內(nèi)參A值。

結(jié) 果

1 各組腦組織超微結(jié)構(gòu)變化 SO組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，未見細(xì)胞自噬結(jié)構(gòu)；I/R組大鼠神經(jīng)元線粒體腫脹，可見空泡樣變性，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及嵴破裂，并見不同程度自噬溶酶體形成(見紅色箭頭)，胞核染色質(zhì)固縮；部分神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡改變，核染色質(zhì)形成半月狀的或結(jié)節(jié)狀的團(tuán)塊附著于核膜下，核膜碎裂；QRHY干預(yù)后較I/R組神經(jīng)元細(xì)胞器損傷明顯減輕，自噬及凋亡程度顯著降低(圖1)。

圖1 各組2d透射電鏡染色結(jié)果(×15000)

2 各組P62 mRNA表達(dá)變化SO組有少量P62 mRNA表達(dá) I/R組大鼠腦缺血再灌注缺血半暗帶P62 mRNA表達(dá)于1 d時(shí)最低(P<0.01)，隨再灌注時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)其表達(dá)仍維持較低水平 (P<0.05)；與I/R組比較，QKL能明顯升高各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)；QRHY能較QKL進(jìn)一步升高各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)。見表1。

表1 大鼠缺血半暗帶P62 mRNA表達(dá)的ΔCT比較

注：與 SO 組比，#P<0.05,▲P<0.01;與I/R組比,*P<0.05;與QKL組比，ΔP<0.05,◇P<0.01

3 各組P62蛋白表達(dá)變化 SO組可檢測(cè)到較弱的P62蛋白表達(dá)，I/R組大鼠腦缺血再灌注缺血半暗帶P62蛋白12 h開始降低，于1 d時(shí)最低(P<0.01)，隨再灌注時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)其表達(dá)仍維持較低水平(P<0.05)；與I/R組比較，QKL能明顯升高各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)；QRHY能較QKL進(jìn)一步升高各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05，P<0.01)。見表2和圖2。

表2 各組P62蛋白表達(dá)的OD值比較

注：與SO組相比，#P<0.05,▲P<0.01;與I/R組相比，*P<0.05;與QKL組比較，ΔP<0.05

4 各組LC3 mRNA表達(dá)變化SO組有少量LC3 mRNA表達(dá)；I/R組大鼠其表達(dá)1d到達(dá)高峰(P<0.01)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降，但3 d時(shí)仍維持較高表達(dá)水平(P<0.05)；與I/R組比較，QKL能明顯降低各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)；QRHY能較QKL進(jìn)一步降低各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)。見表3。

5 各組LC3蛋白表達(dá)變化 假手術(shù)組可檢測(cè)到較弱的LC3蛋白表達(dá)，模型組大鼠腦I/R損傷12 h其表達(dá)開始升高，1 d時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)，其后表達(dá)漸趨下降，但3 d時(shí)仍維持較高水平表達(dá) (P<0.05)；清開靈能明顯降低各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)；清熱化瘀方能較清開靈進(jìn)一步降低各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平 (P<0.05)。見表4和圖3。

表3 各組LC3 mRNA表達(dá)變化比較

注：與 SO 組相比,#P<0.01；與I/R組相比,*P<0.05；與QKL組相比，ΔP<0.05

表4 各組 LC3蛋白表達(dá)的OD值比較

注：與SO組相比，#P<0.01；與I/R組相比,*P<0.05；與QKL組相比，ΔP<0.05

圖2 各組P62蛋白的表達(dá)圖(Western blot)

圖3 各組LC3蛋白的表達(dá)圖(Western blot)

P62作為一種自噬底物，是自噬的首選靶位，在選擇性自噬過程中起重要作用，是最先發(fā)現(xiàn)并被廣泛研究的自噬負(fù)荷物受體，同時(shí)它參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控及自噬過程，在對(duì)抗氧化應(yīng)激及線粒體凋亡等方面起著重要的作用[5]。它可以直接和微管結(jié)合蛋白輕鏈3(LC3)相結(jié)合，通過N端再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的 LC3-II 蛋白形成復(fù)合物，一同在自噬溶酶體內(nèi)降解并引起自噬[6-7]。出現(xiàn)自噬時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中 P62 蛋白不斷被降解；當(dāng)自噬活性減弱或功能缺陷時(shí)，P62 蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積[8-9]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)在自噬體和溶酶體膜上存在，其表達(dá)量的多少可以間接反映自噬體和溶酶體的多少，由此可將LC3 看作自噬體體形成的關(guān)鍵分子[10]。許多研究表明，在包括低氧缺血、局灶性或全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，自噬能夠在神?jīng)元中被誘導(dǎo)，且神經(jīng)元的凋亡可能受自噬調(diào)節(jié)[11-13]。但有關(guān)P62/LC3介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路在腦缺血損傷中的調(diào)控機(jī)制鮮有研究。因此，探討其在腦缺血損傷中的作用，可為腦保護(hù)治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

我們認(rèn)為中風(fēng)病病變的核心在于“腦絡(luò)”，其病機(jī)的核心是氣血逆亂。主要的病機(jī)是痰瘀阻滯腦絡(luò)，痰淤郁久化熱，繼而產(chǎn)生各種毒性物質(zhì)，引發(fā)腦髓受損加重。由于痰瘀火熱密切相關(guān)，故痰毒、瘀毒、熱毒往往交織為患，故認(rèn)為淤痰熱毒并治抗急性腦缺血損傷是提高中風(fēng)療效的關(guān)鍵和重要策略[14]。針對(duì)以上病機(jī)， 本課題組提出“清熱解毒，化瘀通絡(luò)”的治則治法，使毒邪去則絡(luò)脈不再受損而易復(fù)，絡(luò)通則氣血暢，神機(jī)自復(fù)。具有解毒、化痰祛瘀之功效的解毒化瘀方可能正是根據(jù)這一思想所創(chuàng)制。前期研究證實(shí)其可以顯著減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用[15-16]?；谠摲角捌诘目箖?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)，我們推測(cè)其可能通過P62介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞自噬的作用。

本研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注損傷后，P62表達(dá)明顯下調(diào)，而LC3表達(dá)明顯上升，這表明腦缺血損傷后細(xì)胞自噬明顯加劇，而過度激活的自噬可引起細(xì)胞裂解而死亡，即自噬性細(xì)胞死亡[17-18]。清熱化瘀方可能正是通過升高P62的表達(dá)以及減少LC3的表達(dá)從而抑制自噬的過度激活，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)的作用。