王韻橋 蔣筱 夏猛

大量研究表明，失眠與肝郁之間在癥狀層面及疾病層面上均具有密切的聯(lián)系。如有學(xué)者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，失眠患者常伴有焦慮情緒、抑郁情緒，甚至是同時伴有兩種情緒障礙[1]。另外，有學(xué)者則專門對兒童進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，很多兒童存在睡眠問題，且原因多是因?qū)W習(xí)或生活環(huán)境因素造成的不良情緒[2]。在中醫(yī)學(xué)中，這一類疾病被稱為肝郁證失眠，且往往治療困難，易反復(fù)，并導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生，甚至致殘、致死[3]。由此可以發(fā)現(xiàn)，無論是不斷升高的發(fā)病率還是其嚴(yán)重的潛在危害，肝郁失眠都需要引起高度重視。大量的文獻(xiàn)表明，中醫(yī)經(jīng)典方逍遙散具有疏肝理氣、健脾養(yǎng)血的作用，在臨床上對肝郁證失眠患者的治療中收獲了顯著的療效，但是對于其治療肝郁證失眠的具體作用機(jī)制尚不明確。

PI3K/Akt-mTOR是一種在真核細(xì)胞中存在較廣的信號通路[4-5]，對細(xì)胞自噬、凋亡和各種代謝等生命活動有著重要的調(diào)控作用[6]。本次實(shí)驗(yàn)中，課題組以逍遙散作為研究對象，選擇臨床上治療肝郁證失眠的常用且效果明顯的藥物地西泮作為西藥組。以PI3K信號通路為切入點(diǎn)，運(yùn)用Real-Time PCR技術(shù)對各組大鼠海馬體樣本中的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，同時結(jié)合曠場實(shí)驗(yàn)對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，分析逍遙散對于肝郁證失眠模型大鼠行為學(xué)的影響，為逍遙散治療肝郁證失眠的切實(shí)療效提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠50只，體重(200±20) g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002，湖南省實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：43004700037830。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品制備

逍遙散(柴胡15 g、當(dāng)歸15 g、白芍15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、生姜15 g、薄荷6 g、炙甘草6 g)，天王補(bǔ)心丹(酸棗仁10 g、柏子仁10 g、當(dāng)歸身10 g、天門冬10 g、麥門冬10 g、生地黃12 g)購買自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。經(jīng)中藥植化室鑒定符合《中國藥典》2010版相關(guān)要求。

藥劑制備：加水回流提取2次，第一次加10倍水提取2小時，第二次加8倍水提取1.5小時，藥液過濾，合并濃縮至含生藥濃度1 g/mL，4℃無菌保存?zhèn)溆?，用時稀釋適當(dāng)濃度；地西泮片(廣東三才石岐制藥有限公司，批號：170913)，用時以生理鹽水稀釋至1 mg/mL備用。

對氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,簡稱PCPA)制備：將PCPA放入弱堿性生理鹽水中溶解，配制成40 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑及儀器

PCPA(Sigma，批號:64898MJ)；Trizol(Invitrogen，批號:15596-026)；無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；DEPC水(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶，批號:R0010)；PI3K抗體(Abcam，批號:ab151549)；Akt抗體(Abcam，批號:ab8805)；MTOR抗體(Abcam，批號:ab32028)；UVP凝膠成像系統(tǒng)(Thermo，CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 System)；熒光定量PCR儀(ABI，7500)；水平電泳儀(北京市六一儀器廠)；半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO，WSE-4040)。

1.4 模型制備

從大鼠中隨機(jī)選擇6只作為空白組，剩余大鼠采用慢性夾尾刺激和腹腔注射PCPA復(fù)合因子造模法進(jìn)行肝郁證失眠大鼠模型制備[7]。將同一組大鼠置于同一籠中，用止血鉗將除空白組外所有大鼠的尾部夾住，每天持續(xù)刺激45分鐘，令大鼠相互廝打，為保證存活率，以大鼠不受明顯外傷為度進(jìn)行強(qiáng)度控制，連續(xù)20天；造模第16天，開始對各組模型大鼠按1 mL/100 g腹腔注射之前配置好的PCPA混懸液，連續(xù)3天。

1.5 動物分組及給藥

除去空白組6只，最終得到逍遙散高劑量組6只、逍遙散中劑量組6只、逍遙散低劑量組6只及天王補(bǔ)心丹組6只、地西泮組(西藥組)6只，模型組6只。各組大鼠從造模第7天起，以臨床人與大鼠體表面積換算每日給藥：逍遙散高劑量組5 mL/kg、逍遙散中劑量組及天王補(bǔ)心丹組2.5 mL/kg、逍遙散低劑量組1.25 mL/kg、西藥組0.1 mL/kg，空白組和模型組每日給予等量生理鹽水。共持續(xù)2周，在給藥2周后進(jìn)行曠場試驗(yàn)及指標(biāo)檢測。

1.6 取材

大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)完畢后，進(jìn)行斷頭低溫新鮮取腦。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭，置于冰臺上迅速分離海馬，放入-80℃液氮中保存，每組取材6只。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1 宏觀體征觀察 觀察實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠的精神、活動、睡眠、飲食、毛色的變化。

1.7.2 曠場實(shí)驗(yàn) 由Morris視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)測試，在電腦Morris系統(tǒng)中將曠場分為九個象限，每一象限為大小相同的方格。之后將大鼠置于最中心的象限，記錄時間設(shè)置為3分鐘，在3分鐘之內(nèi)記錄其移動的距離、跨越方格的數(shù)量以及活動次數(shù)(梳理毛發(fā)、站立和探索動作)作為檢測指標(biāo)，以評估其活躍程度的變化。

1.7.3 Real-Time PCR實(shí)驗(yàn) 引物序列：引物由天根生物科技有限公司設(shè)計并提供，詳見表1。實(shí)驗(yàn)步驟：用Trizol提取組織樣本中總RNA，取RNA用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性,用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，RT-PCR運(yùn)用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.7.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 按說明書提取各組大鼠海馬組織蛋白；用BCA試劑盒測定并調(diào)整每個樣本蛋白濃度之后上樣；連接電泳裝置及電源，電壓設(shè)為120V恒壓，1.5小時后停止電泳；用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)室溫封閉2小時，用新配制的封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜；用封閉液稀釋各蛋白一抗對應(yīng)的二抗，室溫下孵育膜1小時，PBST洗膜用于圖像采集；加ECL工作液，在凝膠成像儀下曝光成像。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝郁證大鼠宏觀體征觀察

造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好，睡眠、活動、飲食正常，毛質(zhì)光澤柔順。造模1周之后，各模型組大鼠與空白組相比，精神萎靡，活動明顯減少，飲食減少，毛色暗淡，清潔行為減少，易受外界刺激。兩周之后對外界刺激反應(yīng)開始減弱，開始表現(xiàn)出明顯的肝郁證相關(guān)癥狀。藥物治療之后，逍遙散高劑量組、逍遙散中劑量組及西藥組情況改善明顯。在造模前、造模后灌胃前、灌胃后三個時間節(jié)點(diǎn)分別對各組大鼠體重進(jìn)行記錄并計算每組平均體重，發(fā)現(xiàn)造模期間各模型大鼠體重持續(xù)下降，藥物治療之后，各藥物組大鼠體重基本停止減少，逍遙散高劑量組、逍遙散中劑量組及西藥組大鼠體重開始恢復(fù)。

2.2 肝郁證大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果

給藥治療后，與空白組比較，模型組和天王補(bǔ)心丹組移動距離明顯縮短，跨越方格數(shù)和活動次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，接受給藥治療的各組，除天王補(bǔ)心丹組大鼠以外，移動距離明顯增加，跨越方格數(shù)和活動次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中逍遙散中劑量組及西藥組變化最為明顯，大鼠活躍善程度更高。而天王補(bǔ)心丹組與模型組比較，移動距離、跨越方格數(shù)和活動次數(shù)相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組肝郁證失眠大鼠曠場試驗(yàn)測試

注： 與空白組比較，aP<0.05，與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05。

2.3 肝郁證大鼠RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示：與空白組相比，各治療組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量均有增加，其中除天王補(bǔ)心丹組及逍遙散低劑量組，其余各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，除天王補(bǔ)心丹組及逍遙散低劑量組外，其余治療各組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量均上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中逍遙散中劑量組和西藥組上調(diào)最為明顯，治療效果最好，見表3。

表3 各組肝郁證大鼠的PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)

注： 與空白相比比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05。

2.3 肝郁證大鼠WB檢測結(jié)果

WB結(jié)果顯示：與空白組相比，各治療組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量均有增加，其中除天王補(bǔ)心丹組及逍遙散低劑量組，其余各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，除天王補(bǔ)心丹組及逍遙散低劑量組外，其余治療各組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量均上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中逍遙散中劑量組和西藥組上調(diào)最為明顯(P<0.01)，治療效果最好，見表4、圖1。

表4 各組肝郁證大鼠PI3K、Akt、mTOR的蛋白表達(dá)

注： 與空白相比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05。

注：A：空白組；B：模型組；C：逍遙散低劑量組；D：逍遙散中劑量組；E：逍遙散高劑量組；F：天王補(bǔ)心丹組；G：西藥組

圖1Western blot檢測肝郁證大鼠CA1區(qū)PI3K、Akt、mTOR蛋白印跡表達(dá)圖

3 討論

隨著中醫(yī)對細(xì)胞層面研究的不斷深入，現(xiàn)代細(xì)胞研究也為中醫(yī)的理論研究提供了新的思路。目前中醫(yī)對于這一類研究的成果主要體現(xiàn)在以下幾個方面：陰陽理論，尋求人體陰陽的動態(tài)平衡也中醫(yī)的基本治療思路。黃貴華等[8]認(rèn)為細(xì)胞自噬過程是陰陽動態(tài)平衡的微觀體現(xiàn)。許文婷等[9]對這一觀點(diǎn)有了更為詳細(xì)的描述：細(xì)胞自噬與凋亡是以細(xì)胞的對立制約并相互作用為基礎(chǔ)的。這些研究成果，和中醫(yī)理論中關(guān)于陰陽理論的描述基本一致；肝郁氣滯作為一種更為細(xì)致的病因病機(jī)，是中醫(yī)失眠中的常見證型，在臨床上常與情志性疾病相關(guān)。大量研究證明了mTOR通路在抗抑郁及調(diào)節(jié)人的情志方面起著重要作用[10]。同時PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路作為細(xì)胞自噬的經(jīng)典通路，也表明了通過調(diào)控細(xì)胞自噬通路可以達(dá)到疏肝解郁，調(diào)節(jié)人體情志的作用。同時有學(xué)者認(rèn)為如果細(xì)胞自噬被抑制，受損和衰老的細(xì)胞器得不到及時清除，廢物堆積損害人體健康，這個過程也與肝氣不疏相通[11]。

綜上，可以發(fā)現(xiàn)PI3K信號通路作為一種作用十分廣泛的信號通路，它對人體的陰陽平衡、氣機(jī)條暢有著十分重要的作用密切的聯(lián)系，其中與情致相關(guān)的疾病聯(lián)系尤為密切。但是作為如今高發(fā)疾病，目前醫(yī)學(xué)界對肝郁證失眠的作用機(jī)制研究仍非常有限，且大部分并未在細(xì)胞技術(shù)層面予以深入的研究觀察，目前的研究成果提示，肝郁證失眠可能與PI3K/Akt信號通路也具有非常重要的聯(lián)系。所以在本次實(shí)驗(yàn)中，課題組成功復(fù)制肝郁證失眠大鼠模型，而造模方法也與臨床上肝郁證的常見病因類似，然后通過藥物干預(yù)并觀察、檢測動物形態(tài)體征、行為學(xué)及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，來確定肝郁證失眠與PI3K/Akt信號通路的具體聯(lián)系。

課題組發(fā)現(xiàn)，基于生物本身的自我修復(fù)功能和對疾病的應(yīng)激反應(yīng)，與空白組相比，模型組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量已經(jīng)開始部分增加，但由于其程度有限，還達(dá)不到調(diào)控信號通路、條暢情志的作用；與模型組比較，逍遙散中劑量組及高劑量組和西藥組PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量明顯上調(diào)，說明此時該信號通路得以進(jìn)一步激活，開始逐步通過對該信號通路的控制達(dá)到治療肝郁證失眠的目的；而逍遙散低劑量組與天王補(bǔ)心丹組的PI3K、Akt、mTOR表達(dá)量低于逍遙散中劑量組和西藥組，這也與曠場實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相符，說明中藥劑量的高低變化會對治療結(jié)果產(chǎn)生影響，同時滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)心安神的天王補(bǔ)心丹沒有達(dá)到治療肝郁證失眠的目的，這也提示中藥復(fù)方需要在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下辨證施治，若藥不對證，也同樣達(dá)不到治療目的。根據(jù)這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示逍遙散可能是通過上調(diào)肝郁證失眠模型大鼠的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)，從而激活該信號通路，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元，抗抑郁，并最終治療肝郁證失眠的目的。這一結(jié)果與目前國內(nèi)外其他類似研究的結(jié)果基本一致，但其具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)僅為課題前期研究，課題組計劃在今后的實(shí)驗(yàn)中，如條件允許，可以采用多檢測方式、多細(xì)胞靶點(diǎn)、多信號通路同時進(jìn)行，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加符合復(fù)雜的臨床情況，從而為中醫(yī)治療肝郁證失眠的治則治法提供客觀依據(jù)，為今后研究疏肝解郁法治療各種病癥的具體作用機(jī)制拋磚引玉。