呂 瑩,周志剛,陳 思,張小軍

(1. 浙江海洋大學水產學院, 浙江 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產研究所水產品加工與質量安全研究室,浙江 舟山 316021; 3. 舟山市公安司法鑒定中心, 浙江 舟山 316021; 4. 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室, 農業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學觀測實驗站, 浙江 舟山 316021)

赤潮是中國近海四大主要自然災害之一。近幾年,中國貝類毒素污染日趨常態(tài)化和普遍化,且已造成多次重大突發(fā)性中毒事件?，F有腹瀉性貝類毒素(DSP)中以大田軟海綿酸(OA)及其衍生物鰭藻毒素(DTXs)分布最廣、危害最大[1,2]。DSP中毒事件的早期診斷主要通過判斷患者的中毒癥狀,以及分析造成中毒事件的食物樣品來完成。臨床研究表明,OA類毒素能在腸道等組織內長期痕量蓄積,并主要以原型通過尿、糞排出體外。因此,在食物樣品缺乏的案例中,建立體液中OA類毒素殘留的檢測方法對輔助診斷患者的中毒情況極為必要?，F有關于DSP檢測方法多針對貝類組織、水體、藻類等基質建立,鮮見對各種生物體液樣品的應用分析。因此,本文綜述了OA類毒素的理化性質、中毒事件、毒理作用、體內代謝規(guī)律,及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)在生物體液樣品中的應用進展,以期為科學開展相關研究提供背景資料和參考依據。

圖 1 大田軟海綿酸及其衍生物鰭藻毒素的化學結構Fig. 1 Chemical structures of okadaic acid (OA) and dinophysistoxins (DTXs)

1 大田軟海綿酸類毒素

1.1 理化性質

腹瀉性貝類毒素由鰭藻屬(Dinophysisspp.)和原甲藻屬(Prorocentrumspp.)的部分藻類產生,為脂溶性聚醚或大環(huán)內酯化合物[1]。依據其碳骨架結構不同,可將DSP分為3類,其中酸性成分OA及其衍生物DTXs是DSP的主要活性成分,也是分布最廣、危害最大的一類毒素[2]。在有毒藻及貝類中,OA類毒素主要以游離態(tài)和酯化態(tài)存在,游離態(tài)包括OA及其甲基化衍生物DTX-1和同分異構體DTX-2,這些毒素在貝類體內經?；⑺獾壬镛D化過程又形成了酯化態(tài)產物DTX-3族。OA類毒素的基本結構由38個碳骨架組成,含有17個手性中心和3個螺環(huán)縮酮前體基團(見圖1),不溶于水,溶于甲醇、正己烷等有機試劑,熱穩(wěn)定性高[3]。

1.2 中毒事件

統計國內外相關報道[4-22]發(fā)現,近50年來,DSP曾造成超過2.5萬人中毒(見表1),這些中毒事件多由誤食OA類毒素污染的貽貝、扇貝等引起。1961年,荷蘭首次出現人類中毒事件后[4], DSP中毒事件在全球范圍內陸續(xù)均有報道,以歐洲、日本爆發(fā)最為頻繁?；颊叩呐R床癥狀包括腹瀉(92%)、惡心(80%)、嘔吐(79%)、腹痛(53%)等,一般可在2～3 d康復[5]。DSP中毒癥狀與腸胃道疾病癥狀極為相似,容易被人們忽視,其實際發(fā)生率可能遠高于報道數據。

表 1 關于DSP人類中毒事件的報道案例

1.3 毒理作用

絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶參與調節(jié)細胞的基本生理過程,OA類毒素能特異性地抑制該酶的活性[23],導致大量蛋白質去磷酸化并積聚,從而產生多種毒理作用[24,25]。OA類毒素以腸道為靶器官,刺激細胞內環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介質系統,依賴cAMP的蛋白激酶隨著cAMP的升高而被激活,蛋白質磷酸化,細胞大量分泌水、氯及碳酸鹽,抑制對鈉的正常吸收,從而使患者產生急性水瀉毒性[26]。雖然OA類毒素屬于非致命貝類毒素,但卻是強效的癌變促進劑和凋亡誘導因子[27]。研究表明,當消費者慢性或亞慢性暴露于OA及DTXs時可損傷腸黏膜,誘發(fā)胃腸道癌[28]。此外,OA還具有細胞毒性、神經毒性、免疫毒性、遺傳毒性、胚胎毒性等慢性毒性[29]。目前,歐盟規(guī)定貝類產品中DSP限量標準為160 μg/kg(OA當量)[30],歐洲食品安全局(EFSA)在新的毒理學數據基礎上,重新對OA和DTXs限量標準進行了評估,并建議將其修訂為45 μg/kg(OA當量)[31]。

2 大田軟海綿酸類毒素的體內代謝規(guī)律

關于OA類毒素的體內毒理學實驗多以小鼠、大鼠為實驗動物,通過口服、灌胃、腹腔注射進行[25]。一般來說,腹腔注射對實驗動物的毒性最強,其次為灌胃,口服最弱。

據文獻報道,OA對小鼠的口服、灌胃和腹腔注射半數致死量(LD50)分別為192～880[32,33]、760[34]和186～225[35-37]μg/(kg·bw); DTX-1對小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分別為487 μg/(kg·bw)[34]和150 μg/(kg·bw)[37]; DTX-2對小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分別為2 262 μg/(kg·bw)[34]和352 μg/(kg·bw)[35]。

Matias等[37]以液相色譜-熒光分析法(LC-FLD)為檢測手段,系統研究了經單次灌胃50 μg/(kg·bw)氚標記的OA([3H]OA)24 h時小鼠各器官中的毒素代謝情況。結果發(fā)現,腸道內容物中[3H]OA的蓄積量占總量的36.3%,尿、皮、糞和血次之,分別為11.6%、8.3%、6.6%和4.3%,其他組織均低于1%;單次灌胃50 μg/(kg·bw)和90 μg/(kg·bw) [3H]OA劑量下,24 h小鼠血液毒素的質量濃度分別為23 ng/mL和27 ng/mL,尿液毒素的質量濃度分別為151 ng/mL和246 ng/mL[37]。Fujiki和Suganuma等[38]比較了口服和腹腔注射[3H]OA時,小鼠對毒素的代謝情況。研究顯示,口服3 h后77%的[3H]OA蓄積于小鼠胃腸道內容物中,19 h后4%和30%的[3H]OA分別蓄積于小鼠胃腸道內容物和糞便中,肝臟中[3H]OA蓄積量始終僅為1%;而腹腔注射3 h后小鼠胃腸道內容物和肝臟中[3H]OA蓄積量分別占總量的33%和27%, 19 h后二者分別降低至5%和16%[38]。由此推斷,小鼠口服OA后毒素多由腸胃吸收或通過腸肝循環(huán)代謝,并以原型代謝,經尿、糞排出體外;而腹腔注射OA后毒素則通過肝膽循環(huán)排出。

Ito等[32]利用免疫染色法研究了口服75～250 μg/(kg·bw) OA的小鼠在5 min～12 w期間的毒素蓄積和清除情況?？诜?50 μg/(kg·bw) OA劑量(3/8致死量)后,小鼠肺、小腸和胃的損傷分別持續(xù)10 min～8 h、45 min～4 h和60 min～16 h,盲腸、大腸的損傷則分別持續(xù)2～4 h、2 h～4 d;胃和小腸上部毒素殘留均達24 h,盲腸毒素殘留達16 h,心、肺、肝、大腸、腎及盲腸內容物中毒素殘留長達2 w,大、小腸內容物毒素殘留長達4 w[32]。

Vieira等[39]利用液相色譜-串聯質譜法為檢測手段,分析了小鼠經口服500～1 000 μg/(kg·bw) OA后的毒素代謝規(guī)律?？诜?00 μg/(kg·bw) OA 1 h后,小鼠糞便和血液中毒素殘留分別為30～106 ng和66～160 ng/mL;而口服1 000 μg/(kg·bw) OA,小鼠糞便和血液中毒素殘留分別為67～115 ng和128～336 ng/mL[39]。Abal等[34]采用同一手段分析小鼠經灌胃500～1 000 μg/(kg·bw) OA或250～1 000 μg/(kg·bw) DTX-1 24 h內糞便、尿液和血液毒素的代謝規(guī)律。毒代動力學數據顯示,無論是糞便還是尿液的排泄量,OA劑量組均顯著高于DTX-1劑量組;DTX-1最低劑量組(250 μg/(kg·bw))小鼠尿液中毒素在灌胃6 h排泄最快,9～24 h持續(xù)且緩慢排泄。OA和DTX-1均主要通過糞便排出體外,糞便樣品中OA的殘留量與灌胃劑量呈顯著相關性,且次高劑量組(875 μg/(kg·bw) OA)糞便樣本在12 h時殘留量達到最大值,而糞便樣品中DTX-1的殘留量與灌胃劑量不具顯著相關性[33]。該研究說明小鼠對OA和DTX-1的代謝及排泄規(guī)律存在顯著差異,DTX-1腸吸收率要高于OA毒素。

3 生物樣品中大OA類毒素的檢測研究

毒理學研究及臨床案例均發(fā)現,OA類毒素能在腸道等組織內長期痕量蓄積,且經人體吸收后主要以原型通過尿、糞排出[32,34,37,39,40]。食物中毒事件調查往往通過收集并檢測中毒食品來確定致病因素和治療措施,而在食物樣品缺乏的情況下,利用儀器分析技術確證跟蹤病人體液(如血液、尿液、唾液等)中毒素的殘留水平則可達到輔助診斷中毒病因的作用?，F有檢測方法,如生物檢測法(小鼠生物法、細胞檢測法)、色譜分析法(LC-FLD、LC-MS/MS)、生化測試法(免疫分析法、酶活力分析法)多針對貝類組織、水體、藻類等基質建立,鮮見對各種生物體液樣品的應用分析。

表 2 LC-MS/MS測定生物體液樣品中水產生物毒素的文獻報道

TTX: tetrodotoxin; STX: saxitoxin; NEO: neosaxitoxin; DA: domoic acid; MC: microcystin; MeOH: methanol; ACN: acetonitrile; AA: acetic acid; SCX: strong citation exchange; CBA: carboxyl bonded amide; PCX: polymer citation exchange; PA: polyamide; WCX: weak citation exchange; CCX: carboxyl citation exchange; PAX: polymer anion exchange; -: not mentioned.

血液、尿液等生物樣品組成復雜,基體干擾大,對分析方法的選擇性要求更高;而OA類毒素在生物介質中的質量濃度通常低至ng/mL水平,需要采用高靈敏的檢測技術。目前的研究者已從樣品前處理和檢測技術兩方面著手,建立了體液樣品中多種水產生物毒素的定量分析方法,其中以LC-MS/MS最為普遍。表2概括了近年來血、尿、糞樣品中腹瀉性貝類毒素、河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)、麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poison, PSP)、記憶缺失性貝類毒素(amnesic shellfish poison, ASP)及藍藻毒素(cyanobacterial toxin, CTX)的LC-MS/MS檢測方法。

在LC-MS/MS定量分析前,必須對生物樣品進行前處理,去除會干擾結果的物質,提高檢測的準確度。其中,最常用的前處理方法是蛋白質沉淀法,通過添加表面活性劑(三氯乙酸、甲酸等)或二者結合使用,使蛋白質變性析出。Abal等[34]就通過在血液、尿液等樣品中加入乙腈、甲醇等有機溶劑達到沉淀蛋白質的目的,結合離心、過濾等簡單的方法完成樣品的預處理,同時應用LC-MS/MS研究了OA和DTX-1兩種毒素在小鼠體內的代謝過程。

蛋白質沉淀法雖然操作簡單,成本低,但凈化效果較差,基質效應顯著。對于內源性干擾大的復雜樣品,往往選用蛋白質沉淀和固相萃取(SPE)聯用進行前處理。SPE利用固相填料對被測毒素與基質組分的不同吸附作用,通過選擇合適的溶劑進行洗脫,從而實現對目標物的分離、純化和富集。根據相似相溶機理可分為正相SPE、反相SPE、離子交換SPE和吸附SPE;根據其萃取階段又可分為在線SPE和離線SPE。Wang等[40]用甲醇處理尿液中的蛋白質后取上清液,過反相C18固相萃取柱富集,再用甲醇洗脫,洗脫液在濃縮、復溶后經LC-MS/MS分析,OA、DTX-1和DTX-2 3種毒素的檢出限為0.5～0.7 ng/mL。

當單一萃取手段無法達到有效的純化和富集時,多維萃取模式是解決這一問題的有效途徑。已有研究應用雙SPE柱固相萃取的前處理技術,建立了尿液、血漿等生物樣品中河豚毒素的LC-MS/MS檢測法[43]。樣品用2%乙酸稀釋酸化,加入經甲醇活化和水洗除雜后的Supelco C18固相萃取柱進行處理后,再采用SeQuant HILIC固相萃取柱純化河豚毒素,可有效消除生物基質對質譜的離子抑制效應[43]。

在線樣品處理技術通過六通閥將SPE柱與LC-MS/MS連接起來,顯著簡化了樣品的處理過程,可實現生物樣品的高通量處理,已成為了毒物分析領域的研究熱點。Hamelin團隊[42,46]已先后建立了尿液中麻痹性貝類毒素、河豚毒素的在線SPE柱固相萃取-LC-MS/MS檢測法,單個樣品的前處理時間可控制在1 h內?；谠诰€固相萃取-LC-MS/MS技術的生物樣品自動化分析,若能與雙柱,甚至多柱交替萃取模式結合,更可顯著提高毒理學評價和臨床診斷的效率。

4 結論

近年來,與有毒鰭藻、原甲藻伴生的貝類毒素污染事件多發(fā)。消費者一旦誤食OA類毒素污染的貝類產品,其急性中毒癥狀與腸胃道疾病癥狀極為相似;慢性暴露于該類毒素還會誘發(fā)癌變和各種慢性毒性;對中國的近海消費者的食用安全構成威脅。毒理學研究及臨床案例顯示,OA類毒素經人體吸收后主要以原型通過尿、糞排出。尿液樣品簡單易得、收集量大、毒素殘留濃度相對較高,在缺乏中毒食品的情況下,利用儀器分析技術確證跟蹤其中OA類毒素的殘留水平可達到輔助診斷中毒病因的作用。大量應用實例證明LC-MS/MS在復雜生物體液樣品中水產生物毒素分析中的優(yōu)勢,已有學者采用有機試劑去除蛋白質、C18 SPE柱富集等前處理成功建立了血、尿、糞樣品中OA類毒素的檢測方法。雙SPE柱、甚至多SPE柱交替萃取可顯著提高樣品的凈化效果,在線固相萃取系統將實現樣品的快速化和高通量化,均亟須進一步的研發(fā)和應用。