倪德讓，葉興乾，林 琳，孫崇德，孔祥禮，王和玉，王 莉,

（1.貴州茅臺酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州 仁懷 564501；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

在我國，以高粱為原料生產(chǎn)白酒已有700多年的歷史，高粱中淀粉含量高，蛋白質(zhì)、單寧和脂肪等含量適當(dāng)，是釀酒的優(yōu)質(zhì)原料，如茅臺酒、瀘州老窖、劍南春、五糧液等眾多國家優(yōu)質(zhì)白酒均以高粱作為主要原料或單一原料[1]。紅纓子高粱，是貴州省仁懷市本地的一種原生有機糯高粱品種，也是茅臺酒釀造的主要原料[2-3]。相較于東北及其他地區(qū)高粱，紅纓子高粱顆粒堅實、飽滿、均勻，粒小皮厚，其獨特的玻璃質(zhì)地，十分有利于白酒的生產(chǎn)[3]。高粱在我國種植地域十分廣泛，品種多樣，但并不是所有的高粱都適合于釀酒。因此，研究高粱原料品質(zhì)的科學(xué)評定方法和質(zhì)量監(jiān)測體系，對于維持白酒的優(yōu)質(zhì)風(fēng)味和品質(zhì)具有重大意義。

所有高粱品種富含多酚類物質(zhì)[4-7]，包括黃酮類化合物、酚酸和原花色素，它們能夠在發(fā)酵過程中起到抑菌效果，并與白酒風(fēng)味和其營養(yǎng)保健功能密切相關(guān)[8-12]。文獻(xiàn)報道，高粱的基因型及其生長環(huán)境會影響其多酚類化合物的組成和含量，進(jìn)而影響其顏色、外觀和品質(zhì)[13-15]。黑色種皮的高粱品種，其總3-脫氧花青素的含量是紅、棕兩色種皮高粱品種的4 倍[16]，而白色種皮高粱品種中黃烷酮類化合物含量最低，在檸檬黃種皮高粱品種中黃烷酮含量最高[17]。高粱中的多酚類化合物在釀酒過程中對白酒風(fēng)味等有重要的影響，同時也是白酒中功能成分的重要貢獻(xiàn)者。據(jù)報道，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是通過前體物質(zhì)阿魏酸脫羧形成[18]，同時少量的單寧經(jīng)過蒸煮及發(fā)酵也能變成芳香物質(zhì)從而賦予酒特殊的香味[19]。

指紋圖譜技術(shù)在目前被廣泛應(yīng)用于摻假中藥鑒別、食品評價、種子檢測和鑒定等領(lǐng)域，也常用于分析酒中揮發(fā)性成分特征[20-23]。因此，本實驗基于多酚類物質(zhì)建立紅纓子高粱高效液相色譜指紋圖譜，以期為紅纓子高粱原料的品種鑒別、質(zhì)量監(jiān)控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品預(yù)處理：17 批次紅纓子高粱分別取自貴州省仁懷市及周邊不同地區(qū)，見表1。8 批次其他釀酒高粱品種均由市場購得，樣品分別研磨，過35 目篩（500 μm），密封保存于-20 ℃。

色譜級酚酸、黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：氯化芹菜定（批號：Z10M10H87072）和氯化木犀草定（批號：Z10M10H87073） 上海源葉生物科技有限公司；柚皮素（批號：L1701073）、芹菜素（批號：C1412096）、花旗松素（批號：C1412096）、木犀草素（批號：E1731036）、原兒茶酸（批號：072K3446）、咖啡酸（批號：B1802106）和阿魏酸（批號：G1628090）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-香豆酸（批號：C10365642） 上海麥克林生化科技有限公司。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表 1 高粱樣品信息Table 1 Information about the sorghum samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

e2695分析型高效液相色譜儀（2998二極管陣列檢測器） 美國Waters公司；3K15離心機 美國Sigma-Aldrich公司；MS105DU電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；ZM200超離心粉碎儀 德國Retsch GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品準(zhǔn)備

樣品：準(zhǔn)確稱取2 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入30 mL 80%冰乙醇搖床振蕩提取15 min。提取結(jié)束后在3 000 r/min離心10 min。移出上清液，殘渣再提取2 次，合并3 次上清液，用0.45 μm濾膜過濾。將過濾后的上清液放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，設(shè)置45 ℃，在真空條件下蒸干，并用甲醇定容至10 mL。使用0.22 μm濾膜過濾后保存于-80 ℃，用于液相色譜分析[24]。標(biāo)準(zhǔn)品：取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，各自用純甲醇溶解，均使用0.22 μm濾膜過濾后用于液相色譜分析。

1.3.2 高粱多酚類物質(zhì)指紋圖譜建立

分別取25 批高粱樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行高效液相色譜指紋圖譜分析。檢測條件：ZORBAX C18RP-HPLC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；洗脫梯度：5%～15% B，5 min；15%～50% B，40 min；50%～70% B，2 min；70%～100% B，1 min；100% B，7 min；100%～5% B，1 min；5% B，9 min；檢測波長288 nm[25]。以花旗松素的色譜峰（S）為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積比值。將所有樣品的液相色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進(jìn)行處理，生成相應(yīng)的高粱原料高效液相色譜指紋圖譜[26]。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 精密度

按1.3.2節(jié)色譜條件取某一樣品提取液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對峰面積與相對保留時間。

1.3.3.2 穩(wěn)定性

取某一樣品提取液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對峰面積與相對保留時間。

1.3.3.3 重復(fù)性

稱取某一樣品高粱全籽粒粉末共6 份，按1.3.1節(jié)平行制備供試液，進(jìn)行測定，計算各色譜峰的相對峰面積與相對保留時間。

1.3.4 高效液相色譜指紋圖譜相似度的計算

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進(jìn)行處理，將高效液相色譜實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件中，為減小極端數(shù)據(jù)的影響，選擇中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.1，運用多點校正方法對色譜峰進(jìn)行匹配，計算樣品之間的相似度。

1.3.5 聚類分析

為進(jìn)一步觀察不同產(chǎn)地不同品種之間的差異，本實驗應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，以所有樣品的共有峰峰面積為聚類參數(shù)，將所得的25 個樣品的數(shù)據(jù)，按照組之間聯(lián)接和歐式距離聯(lián)用的方法進(jìn)行聚類分析，分析不同釀酒高粱樣品的親疏程度。

1.3.6 主成分分析

將所有高粱樣品的共有峰峰面積運用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析，解析樣品的主成分得分，用于不同品種釀酒用高粱的差異模式識別。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 精密度結(jié)果

取S7號樣品按照1.3.1節(jié)方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.00%～0.26%之間，相對峰面積RSD在0.00%～4.06%之間，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.1.2 穩(wěn)定性結(jié)果

取S7號樣品按照1.3.1節(jié)方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，測得各共有峰的相對保留時間RSD在0.00%～0.186%之間，各共有峰的相對峰面積RSD在0.00%～0.38%之間，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性結(jié)果

分別取S7號樣品6 份，按照1.3.1節(jié)方法制備供試品溶液6 份，分別進(jìn)樣分析，測得各共有峰的相對峰面積RSD在0.00%～0.19%之間，各共有峰的相對保留時間RSD在0.00%～0.42%之間，說明所用方法重復(fù)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

將所得的25 批高粱多酚色譜圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入到國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）”，得到25 批高粱樣品的色譜疊加圖（圖1）以及各樣品相似度結(jié)果（表2）。由表2可以看到，來自貴州省不同地區(qū)的紅纓子高粱樣品在共有模式下的相似度均在0.97以上，樣品之間具有極高的相似度，不同產(chǎn)地的各批次紅纓子樣品的質(zhì)量比較穩(wěn)定。對于其他釀酒高粱品種，在共有模式下與紅纓子高粱的相似度均低于0.90，說明在這部分高粱的多酚類化合物中，能與紅纓子高粱相匹配的共有峰的占比較少，因此，可通過高粱多酚化合物高效液相色譜指紋圖譜將其與紅纓子高粱進(jìn)行區(qū)分。

圖 1 25 批高粱樣品多酚類化合物的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig. 1 Overlapped HPLC fingerprints of phenolics from 25 batches of sorghum samples

表 2 共有模式下高粱樣品的相似度評價結(jié)果Table 2 Similarity evaluation of sorghum samples under common pattern

2.3 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定及基于共有峰相對峰面積的聚類分析

圖 2 25 批高粱樣品高效液相色譜指紋圖譜共有模式Fig. 2 HPLC chromatograms showing peaks common to 25 batches of sorghum samples

采用標(biāo)準(zhǔn)品比對結(jié)合高效液相色譜分析，通過保留時間和對比文獻(xiàn)，匹配到共有色譜峰22 個，如圖2所示。通過保留時間、標(biāo)準(zhǔn)品比對及文獻(xiàn)檢索，確認(rèn)了共有峰中的11 個峰，其中，4號峰為原兒茶酸（13.645 min），5號峰為花旗松素己糖苷（14.091 min），10號峰為咖啡酸（18.445 min），11號峰為木樨草定（19.177 min），13號峰為芹菜定（20.889 min），14號峰為4-香豆酸（23.042 min），15號峰為阿魏酸（24.924 min），16號峰為花旗松素（25.451 min），17號峰為木犀草素（34.857 min），18號峰為芹菜素（40.278 min），19號峰為柚皮素（40.814 min）[25]。

根據(jù)以上22 個共有峰的相對峰面積，應(yīng)用SPSS 22.0軟件對各批次的高粱樣品進(jìn)行分析，形成25×22 階數(shù)據(jù)矩陣，采用歐氏距離類平均法作為樣品聚類依據(jù)。分析結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)判別條件距離為10時，25 批高粱樣品共聚為4 大類，其中，大部分紅纓子高粱S1～S5、S7～S9及S11～S17在更小的判別距離上聚為一類，而S6和S10單獨聚為一類，但二者在判別距離為20時仍能與其他紅纓子高粱聚為一類。因此，通過聚類分析能將紅纓子高粱與其他品種釀酒高粱明顯區(qū)分開。

圖 3 聚類分析結(jié)果Fig. 3 Results of hierarchical cluster analysis

2.4 主成分分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對各共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對25 批高粱樣品指紋圖譜所得的22 個共有峰進(jìn)行主成分分析，求得相關(guān)矩陣的特征值及其方差，見表3。選取特征根大于1的前3 個因子，其累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到84.383%，因此樣本間內(nèi)在的相互關(guān)系可較好地表現(xiàn)出來，可用于代替所有高粱樣品指紋圖譜22 個共有峰的大部分信息，故選取這3 個因子分別作為主成分1～3。

表 3 主成分特征值及方差Table 3 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小和貢獻(xiàn)方向，見表4。在主成分1上，共有峰4～17和峰19、21有較高的正載荷，峰22有較高的負(fù)載荷，說明主成分1反映的主要為峰4～17、19和21中提取得到的綜合信息。在主成分2中，峰1～3和峰20有較高載荷，說明主成分2主要受變量峰1～3、20影響。主成分3上峰18有較高的正載荷，峰1有較高的負(fù)載荷，故主成分3是由峰1和18所決定的。

對上述主成分載荷值進(jìn)行計算，可得到各主成分的線性模型，將各樣本數(shù)據(jù)帶入模型，可得到各批次樣品的主成分得分，如表5所示。主成分得分見圖4，紅纓子高粱樣品S1～S5、S7～S8、S11～S17整體分布較為接近，說明各批次紅纓子高粱質(zhì)量比較接近，而S6、S9和S10分布位置相對較為獨立，這與聚類的結(jié)果保持基本一致。從表5可看出，S6、S9和S10的綜合主成分得分在所有樣品中排名前三，因此推測多酚含量的差異導(dǎo)致其在聚類分析中未能與其他紅纓子高粱樣品聚在一類。此外，其他品種高粱均與紅纓子高粱分布較遠(yuǎn)，同時紅纓子高粱樣品的綜合主成分得分均高于其他品種高粱，因此可以與其他品種進(jìn)行很好的區(qū)分。

表 4 共有峰化合物及主成分載荷矩陣Table 4 Loading matrix and principal components

表 5 樣品主成分得分Table 5 Principal component scores and synthetic scores for 25 sorghum samples

圖 4 不同品種高粱樣品的主成分分析得分Fig. 4 PCA score plots for 25 sorghum samples

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，紅纓子高粱提取物中最豐富的多酚化合物為花旗松素及其糖苷類化合物，與其他紅皮高粱多酚化合物的研究基本一致[27]。不同品種高粱中多酚化合物含量和種類有顯著差異，其中基因型、灌溉和溫度是影響高粱多酚化合物差異的主要因素[28-30]。而研究也證明不同品種高粱多酚提取物具有不同的抗氧化活性[28]，因此針對不同產(chǎn)地釀酒高粱品種中所含的多酚類化合物進(jìn)行分析和品種區(qū)別，對釀酒高粱的綜合利用具有積極意義。

本實驗運用相似度分析、聚類分析和主成分分析對不同釀酒高粱樣品中的多酚類化合物高效液相色譜指紋圖譜進(jìn)行分析。經(jīng)過相似度評價發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的紅纓子高粱樣品間相似度均大于0.97，說明不同地區(qū)種植的紅纓子樣品的質(zhì)量相對穩(wěn)定。對于其他釀酒高粱樣品，在共有模式下與紅纓子高粱的相似度均在0.90以下，說明其他品種釀酒高粱和紅纓子高粱在多酚類化合物組成上存在較大的差異，可通過高效液相色譜指紋圖譜將其與紅纓子高粱區(qū)分開。

進(jìn)一步通過聚類分析和主成分分析對指紋圖譜進(jìn)行綜合評價。聚類分析發(fā)現(xiàn)，大部分紅纓子高粱在較小判別距離上能單獨聚為一類，從而與其他高粱品種區(qū)分開。而有個別紅纓子高粱樣品單獨聚為一類，通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，這些個別紅纓子樣品的得分明顯高于其他紅纓子樣品，即該差異由多酚類含量差異導(dǎo)致。通過相似度評價結(jié)合聚類分析與主成分分析，能夠有效且快速的將紅纓子高粱與其他釀酒高粱品種區(qū)分開，為紅纓子高粱的品種識別和質(zhì)量監(jiān)控提供新思路。