閔鈺,魏雪團(tuán)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

亞精胺(spermidine)是一種具有強(qiáng)烈生物活性的低分子脂肪族含氮堿[1],作為多胺的一種，廣泛分布于生物體內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、組織再生、DNA和RNA的穩(wěn)定等過(guò)程，在細(xì)胞代謝中起重要作用[2-5]。隨著人們對(duì)亞精胺的逐步研究，發(fā)現(xiàn)亞精胺在機(jī)體健康和疾病方面具有重要功能，具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、延緩衰老、提高記憶力、保護(hù)心血管、預(yù)防癌癥等多種生物活性[6-9]。有研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，人體內(nèi)亞精胺濃度逐漸降低，這可能會(huì)影響人體的健康與壽命[10-13]。而通過(guò)外源攝入適量亞精胺來(lái)實(shí)現(xiàn)人體內(nèi)亞精胺濃度的平衡，可能是促進(jìn)健康、延緩衰老的有效策略[14-15]。

目前已報(bào)道多種微生物具有合成亞精胺的能力[16-19]。在微生物體內(nèi)亞精胺可由腐胺(putrescine)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)合成，腐胺在亞精胺合成酶(spermidine synthase)作用下接受S-腺苷甲硫氨酸脫羧提供的氨丙基生成亞精胺[20-22]。KIM等[23]通過(guò)在釀酒酵母中強(qiáng)化表達(dá)鳥氨酸脫羧酶SPE1，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶SPE2和亞精胺合成酶SPE3，同時(shí)敲除了鳥氨酸脫羧酶的抑制基因OAZ1，亞精胺的產(chǎn)量達(dá)到了63.6 mg/L。隨后研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)一步敲除多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TPO1，亞精胺的產(chǎn)量進(jìn)一步提升，最終通過(guò)發(fā)酵放大產(chǎn)量達(dá)到了224 mg/L[24]。也有研究者通過(guò)在集胞藻中強(qiáng)化表達(dá)精氨酸脫羧酶Adc1和Adc2基因，提高了細(xì)胞內(nèi)亞精胺產(chǎn)量[25]。然而，目前的亞精胺產(chǎn)量普遍偏低，亞精胺合成機(jī)制和代謝工程育種還有待進(jìn)一步發(fā)展。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有安全性良好、生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[26-27]。隨著芽胞桿菌遺傳背景和分子操作工具的不斷完善和發(fā)展，芽胞桿菌已發(fā)展成為新的代謝工程底盤微生物，目前已逐漸被用來(lái)生產(chǎn)各種營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和食品添加劑[28-29]，但目前尚未有通過(guò)解淀粉芽胞桿菌合成亞精胺的相關(guān)報(bào)道。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)已預(yù)測(cè)解淀粉芽胞桿菌含有亞精胺合成途徑相關(guān)基因：speE基因編碼亞精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亞精胺合成酶催化下生成亞精胺。speE基因處于至關(guān)重要的位置，是合成亞精胺的關(guān)鍵，然而其功能尚未通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過(guò)基因缺失和回補(bǔ)表達(dá)技術(shù)，從體內(nèi)水平探究speE基因?qū)喚泛铣傻挠绊?，首次證實(shí)了speE基因在解淀粉芽胞桿菌亞精胺合成中的功能，為后續(xù)構(gòu)建亞精胺高產(chǎn)工程菌株提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用到的菌株和質(zhì)粒如表1和2所示。其中大腸桿菌DH5α用于構(gòu)建載體，HSPM1為本實(shí)驗(yàn)室保存的1株高產(chǎn)SAM的工程菌株。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株

表2 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒

注：Tetr：四環(huán)素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：溫敏型復(fù)制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物見表3。

1.1.3 主要試劑

TransStartRFastPfu DNA聚合酶和 TransStartReasyTaqDNA聚合酶,北京全式金公司；dNTPS、DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DL5000 Marker,TaKaRa公司；DNA抽提試劑盒,武漢楚誠(chéng)正茂科技工程有限公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒,美國(guó)OmegaBio-Tek公司；基因引物合成、測(cè)序,武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；乙腈為色譜級(jí)，其他主要生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)純。

表3 本研究所使用的PCR引物

注：粗體為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，下劃線為重疊延伸拼接SOE-PCR的重疊區(qū)域

1.1.4 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基加15～20 g/L的瓊脂粉?？股嘏囵B(yǎng)基添加相應(yīng)抗生素終質(zhì)量濃度為20 μg/L。亞精胺發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：木糖20.0，(NH4)2SO46.3，蛋白胨10.0，玉米漿20，NaCl 2.5，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 4.2，尿素2.0，天冬氨酸3.0，pH 6.5。

1.1.5 儀器與設(shè)備

Thermal Cycler(My Cycler)PCR儀，美國(guó) Bio-Rad 公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；Agilent Technologies1260高效液相色譜，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 敲除載體的構(gòu)建

2014年3 月—2017年1月間，采用回顧性、抽樣調(diào)查方法，選擇118例在重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院診治的老年膝關(guān)節(jié)周圍骨腫瘤患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：就診的初發(fā)未治膝關(guān)節(jié)周圍骨腫瘤患者；年齡≥60歲；膝關(guān)節(jié)周圍骨腫瘤診斷依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)；既往未曾治療；具有手術(shù)指征與化療指征；本研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神疾病患者；合并嚴(yán)重心肝腎異?；颊撸蝗焉锱c哺乳期婦女。根據(jù)治療方法不同將其分為各59例患者的觀察組與對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比基礎(chǔ)資料，兩組患者間無(wú)差異。見表1。

以B.amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，利用上游同源臂引物(ΔspeE-AF,ΔspeE-AR)和下游同源臂引物(ΔspeE-BF，ΔspeE-BR)分別擴(kuò)增出同源臂序列A和B，產(chǎn)物純化回收后通過(guò)SOE-PCR用引物ΔspeE-AF，ΔspeE-BR將A和B連接起來(lái)，并與T2(2)-ori載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶BamH I和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。鈣轉(zhuǎn)化成功后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并送往測(cè)序公司測(cè)序，構(gòu)建成功的敲除質(zhì)粒命名為T2(2)-oriΔspeE。

1.2.2 基因敲除菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入HSPM1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h。挑選轉(zhuǎn)化子單菌落于Kan平板上劃線，培養(yǎng)8～12 h后用進(jìn)行PCR菌落驗(yàn)證(引物T2-F,T2-R)。將電轉(zhuǎn)正確的菌株45 ℃下進(jìn)行單交換，ΔspeE-YF引物和T2引物驗(yàn)證；獲得的單交換菌株在37 ℃下雙交換，挑選在LB板上長(zhǎng)而在Kan抗性板上不長(zhǎng)的單菌落，用ΔspeE-YF和ΔspeE-YF驗(yàn)證，篩選到敲除菌株，命名為HSPM1ΔspeE。

1.2.3 游離表達(dá)載體的構(gòu)建

以分別以B.subtillis168基因組、B.amyloliquefaciensHZ-12基因組和B.licheniformisWX-02基因組，根據(jù)表3相對(duì)應(yīng)的引物，擴(kuò)增出P43啟動(dòng)子、speE基因、終止子TamyL。純化回收PCR產(chǎn)物，以P43-F、TamyL-R為引物通過(guò)SOE-PCR連接起來(lái)，與pHY300PLK質(zhì)粒分別用BamH I和XbaI進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶連接PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。用pHY300-F和pHY300-R對(duì)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，初步確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后，抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建成功的游離表達(dá)載體命名為pHYspeE。

1.2.4 基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

將抽提的pHYspeE和空載體pHY300PLK電轉(zhuǎn)化至HSPM1ΔspeE感受態(tài)中，涂布于Tet抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)。挑選轉(zhuǎn)化子單菌落于Tet平板上劃線，用pHY300-F、pHY300-R進(jìn)行PCR菌落驗(yàn)證。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件

1.2.6 亞精胺液相檢測(cè)

取0.5 mL發(fā)酵液與1.5 mL 0.4 mol/L的高氯酸，混合酸提1 h，(12 000 r/min下離心5 min。吸取250 μL上清液，并依次加入100 μL(1 mg/mL)1, 7-二氨基庚烷，75 μL飽和NaHCO3溶液，50 μL 2 mol/L NaOH溶液以及500 μL(5 mg/mL丙酮)丹磺酰氯衍生劑，上下顛倒混勻。50 ℃水浴，避光反應(yīng)45 min。再加入25 μL體積分?jǐn)?shù)25% NH3·H2O并上下顛倒混勻，繼續(xù)放于50 ℃水浴中，避光靜置15 min。最后加入30 μL 6 mol/L HCl和575 μL乙腈，10 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液0.22 μm有機(jī)膜過(guò)膜進(jìn)行測(cè)定。

液相檢測(cè)使用ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱，流動(dòng)相采用超純水和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 speE基因缺失菌的構(gòu)建及其對(duì)亞精胺合成的影響

2.1.1speE基因缺失菌的構(gòu)建

根據(jù)表3中引物獲得T2(2)-oriΔspeE敲除質(zhì)粒的上下游同源臂，分別為546、520 bp，其中speE基因和其啟動(dòng)子一同設(shè)計(jì)為被敲掉部分，SOE-PCR產(chǎn)物大小為1 066 bp。SOE-PCR融合產(chǎn)物與T2(2)-ori載體分別用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切、酶連后鈣轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。PCR驗(yàn)證顯示條帶正確的單菌落，抽提質(zhì)粒測(cè)序并用BamHⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1-a所示，質(zhì)粒雙酶切的跑膠條帶大小與預(yù)期相符合，測(cè)序結(jié)果顯示正確，表明敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔspeE構(gòu)建成功。

將敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔspeE電轉(zhuǎn)化至HSPM1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)單雙交換篩選敲除菌株。抽提正確敲除菌株和未敲除菌株DNA，以speE-YF/speE-YR為引物，擴(kuò)增的片段分別是1 291和2 232 bp，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1-b。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往測(cè)序公司測(cè)序，比對(duì)結(jié)果正確，表明HSPM1敲除speE基因菌株構(gòu)建成功，命名為HSPM1ΔspeE。

a-重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔspeE的雙酶切驗(yàn)證; b- HSPM1ΔspeE菌株的PCR驗(yàn)證;泳道 1：speE基因上下同源臂SOE-PCR融合片段;泳道 2：BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒T2(2)-ori;泳道 3：BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒T2(2)-oriΔspeE;泳道 4:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR驗(yàn)證HSPM1(2 232 bp);泳道 5:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR驗(yàn)證HSPM1ΔspeE(1 291 bp)

2.1.2speE基因缺失對(duì)亞精胺合成的影響

speE基因編碼亞精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亞精胺合成酶催化下生成亞精胺。為了考察speE基因?qū)喚泛铣傻挠绊懀凑詹牧吓c方法中1.1.5和1.2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HSPM1ΔspeE進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期60 h。用分光光度計(jì)測(cè)生物量OD600，HPLC檢測(cè)亞精胺含量。結(jié)果如圖2所示。

圖2 speE基因缺失對(duì)亞精胺合成的影響

從發(fā)酵驗(yàn)證圖上看出，HSPM1與HSPM1ΔspeE的生物量OD600無(wú)顯著差別。對(duì)照菌株HSPM1亞精胺產(chǎn)量為36.6 mg/L，而工程菌株HSPM1ΔspeE，未檢測(cè)到亞精胺。在細(xì)菌的生長(zhǎng)未受太大影響的情況下，工程菌株HSPM1ΔspeE未檢測(cè)到亞精胺，說(shuō)明敲除speE基因后阻斷了亞精胺的合成，亞精胺的缺失是由speE基因引起，而不是生物量的降低。為了進(jìn)一步確認(rèn)亞精胺的降低是由speE基因缺失引起，構(gòu)建speE基因回補(bǔ)菌株。

2.2 speE基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證

2.2.1speE基因回補(bǔ)表達(dá)菌株的構(gòu)建

由于敲除speE基因后，完全不產(chǎn)亞精胺，推測(cè)亞精胺合成能力的喪失是由speE基因引起，為了證實(shí)speE基因在解淀粉芽胞桿菌中的功能，在HSPM1 ΔspeE菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建speE回補(bǔ)表達(dá)菌株，探究speE基因在解淀粉芽胞桿菌中對(duì)亞精胺合成的影響。

根據(jù)表3的引物擴(kuò)增出P43啟動(dòng)子、speE基因、TamyL終止子大小與理論值大小一致(分別是305、831和501 bp)。SOE-PCR產(chǎn)物大小為1 637 bp，純化后與pHY300PLK載體分別用BamH I和XbaI進(jìn)行酶切，用T4連接酶酶連后鈣轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。選取驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒并用BamH I和XbaI酶切質(zhì)粒，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3-a，條帶大小與預(yù)期符合一致，測(cè)序結(jié)果顯示正確，表明pHY-speE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

游離表達(dá)質(zhì)粒pHY-speE電轉(zhuǎn)化至HSPM1ΔspeE中，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用pHY300-F、pHY300-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖3-b。并送往測(cè)序公司進(jìn)一步驗(yàn)證堿基序列，比對(duì)結(jié)果無(wú)誤后表明HSPM1ΔspeE/pHYspeE工程菌株構(gòu)建成功。

a-重組質(zhì)粒pHY-speE的雙酶切驗(yàn)證；b-菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的PCR驗(yàn)證;泳道1：speE基因、P43啟動(dòng)子、TamyL終止子SOE-PCR融合片段;泳道2：BamH I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pHY300PLK;泳道3：BamH I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pHY-speE;泳道4～5:引物pHY300F和pHY300R驗(yàn)證HSPM1ΔspeE/pHYspeE電泳圖

2.2.2speE基因回補(bǔ)對(duì)亞精胺合成的影響

按照材料與方法中1.1.5和1.2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HSPM1、HSPM1ΔspeE、HSPM1ΔspeE/pHY300、HSPM1ΔspeE/pHYspeE進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期60 h。發(fā)酵終點(diǎn)檢測(cè)生物量OD600和亞精胺產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示。

圖4 speE基因回補(bǔ)對(duì)亞精胺合成的影響

從圖4看，4株工程菌的生物量OD600值無(wú)明顯差別。工程菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的發(fā)酵產(chǎn)量是62.32 mg/L，與對(duì)照菌HSPM1ΔspeE相比，回補(bǔ)speE基因后，亞精胺合成得到恢復(fù)，甚至高于未敲除speE基因的初始菌株HSPM1(33.34 mg/L)，這可能是由于游離表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)高所引起的。上述結(jié)果表明基因互補(bǔ)后，被阻斷的亞精胺合成途徑被修復(fù)，亞精胺的合成能力也得到恢復(fù)，進(jìn)一步證實(shí)了speE基因是亞精胺合成途徑上的關(guān)鍵基因，證實(shí)了speE基因在亞精胺合成中的必要性，鑒定了speE基因在解淀粉芽胞桿菌中的功能。

3 結(jié)論

亞精胺是一種具有廣泛生物活性的生物胺，參與人體各類代謝反應(yīng)。但是其高效生物合成卻一直是廣大科研工作者難以攻破的難題。本研究首次探究了解淀粉芽胞桿菌所預(yù)測(cè)的speE基因在亞精胺合成中的功能，成功構(gòu)建了speE基因的缺失菌株HSPM1ΔspeE、回補(bǔ)菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE。通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)缺失speE并不會(huì)影響菌株的生物量，但卻顯著影響亞精胺的產(chǎn)量，直接導(dǎo)致菌株不產(chǎn)亞精胺；回補(bǔ)speE基因后菌株恢復(fù)亞精胺合成能力，從體內(nèi)水平證實(shí)了speE基因在亞精胺合成中的功能。本研究首次證實(shí)了speE基因在解淀粉芽胞桿菌合成亞精胺中的功能，為亞精胺高產(chǎn)菌株的代謝工程育種提供了重要的基因資源。