林燁玨 唐成武 費(fèi)卯云

[摘要] 目的 探討肝癌組織中Mortalin表達(dá)水平對術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。 方法 回顧性分析2010年5月～2015年10月間在本院接受手術(shù)治療的150例肝細(xì)胞肝癌患者的臨床資料。Western blot 法檢測肝癌標(biāo)本內(nèi)的Mortalin表達(dá)水平，采用ROC曲線和Kaplan-Meier法分析Mortalin表達(dá)水平對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。 結(jié)果 肝癌組織Mortalin表達(dá)水平對術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的曲線下面積（AUC）為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，將肝癌組織Mortalin相對表達(dá)水平>2.14的患者納入高表達(dá)組（n=69），而肝癌組織Mortalin相對表達(dá)水平<2.14的患者納入低表達(dá)組（n=81）。Kaplan-Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有57例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)（3年無復(fù)發(fā)生存率為17.39%）;低表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有10例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)（3年無復(fù)發(fā)生存率為87.65%），低表達(dá)組3年無復(fù)發(fā)生存率明顯優(yōu)于高表達(dá)組（P<0.01，兩組間復(fù)發(fā)風(fēng)險比：10.9915， 95%可信區(qū)間：6.6338～18.2119）。 結(jié)論 肝癌組織Mortalin表達(dá)水平與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，Mortalin表達(dá)水平升高則預(yù)示著術(shù)后早期復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌;表達(dá);肝切除;復(fù)發(fā);Mortalin

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）05-0009-04

Effect of Mortalin expression level on postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma

LIN Yejue? ?TANG Chengwu? ?FEI Maoyun

Department of Surgery， the First People's Hospital Affiliated to Huzhou University， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Mortalin expression level on postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma. Methods The clinical data of 150 patients with hepatocellular carcinoma who underwent surgery in our hospital from May 2010 to October 2015 were retrospectively analyzed. The expression of Mortalin in liver cancer specimens was detected by Western blot. The effect of Mortalin expression on the recurrence of liver cancer was analyzed by ROC curve and Kaplan-Meier method. Results The area under the curve （AUC） of Mortalin expression in hepatocarcinoma was 0.852， the specificity was 86.75%， the sensitivity was 85.07%， and the best interpretation was 2.14（P<0.01）. According to the results of ROC curve analysis， patients with liver cancer tissue Mortalin relative expression level greater than 2.14 were included in the high expression group （n=69）， while those with liver cancer tissue Mortalin relative expression level less than 2.14 were included in the low expression group（n=81）. Kaplan-Meier survival analysis showed that 57 patients in the high expression group had recurrence within 3 years after operation（3 years recurrence-free survival rate was 17.39%）; 10 patients had recurrence within 3 years after operation in low-expression group （3 years recurrence-free survival rate was 87.65%）. The 3-year recurrence-free survival rate of the low-expression group was significantly better than that of the high-expression group（P<0.01， the risk ratio of recurrence between the two groups：10.9915， 95% confidence interval： 6.6338-18.2119）. Conclusion The expression level of Mortalin in hepatocellular carcinoma is significantly correlated with postoperative recurrence of liver cancer.The increased expression of Mortalin predicts early recurrence and poor prognosis.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; Expression; Hepatectomy; Recurrence; Mortalin

肝癌是我國目前發(fā)病率第三的腫瘤，而其致死率位列第二，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害國民健康的公共衛(wèi)生難題[1-3]。手術(shù)切除目前是除肝移植之外針對肝癌最有效的治療手段[4]。然而肝癌手術(shù)切除后仍有非常高的復(fù)發(fā)率，導(dǎo)致長期生存率不甚理想，給家庭社會帶來巨大的精神損失和壓力[5，6]。因此需要深入探索肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的機(jī)制及危險因素，并找到預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的治療策略及靶點(diǎn)，以改善肝癌術(shù)后長期生存。Mortalin是熱休克蛋白70族蛋白的一種，又被稱作GRP75，最早是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，廣泛存在細(xì)胞器內(nèi)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生等作用[7-10]。本研究旨在探討肝細(xì)胞癌組織中Mortalin表達(dá)水平對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性研究2010年5月～2015年5月間在本院接受手術(shù)治療的150例肝細(xì)胞肝癌患者，入組標(biāo)準(zhǔn)[11]：年齡75歲以下;無全身轉(zhuǎn)移;術(shù)后生存期>6個月;隨訪資料完整;均簽署治療知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：血液系統(tǒng)疾病;術(shù)后生存期<6個月。在所有入組的患者中男113例、女37例，平均年齡（56.09±6.68）歲，其中102例接受腹腔鏡肝癌根治術(shù)，48例接受開放肝癌根治術(shù)，平均術(shù)前甲胎蛋白（AFP）水平為（453.42±75.59）ng/mL。

1.2 肝癌組織Mortalin表達(dá)水平檢測

取標(biāo)本庫中對應(yīng)患者手術(shù)組織標(biāo)本，按照蛋白提取試劑盒的說明書，制備蛋白標(biāo)本，BCA法測蛋白濃度。取20 μL樣品上樣，使用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，半干式電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，Mortalin一抗孵育過夜，β-actin二抗室溫孵育2 h。ECL顯影和定影。Mortalin蛋白大小為74 ku;β-actin蛋白大小為43 ku。Mortalin相對含量=Mortalin灰度值/β-actin灰度值。

1.3 隨訪及觀察指標(biāo)

所有患者均接受術(shù)后定期隨訪（術(shù)后半年內(nèi)每個月1次，其后每3個月1次），收集患者資料，包括3年內(nèi)復(fù)發(fā)情況及復(fù)發(fā)時間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);Mortalin表達(dá)對術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測作用采用ROC曲線分析;患者生存資料采用Kaplan-Meier法分析。所有統(tǒng)計(jì)均由MEDCALC15.2軟件完成，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織Mortalin表達(dá)水平對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

運(yùn)用MEDCALC15.2軟件將患者復(fù)發(fā)情況（無復(fù)發(fā)=0，復(fù)發(fā)=1）與肝癌組織Mortalin表達(dá)水平繪制ROC曲線（圖1），測得Mortalin表達(dá)水平對術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的曲線下面積（AUC）為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。

2.2 肝癌組織Mortalin表達(dá)對術(shù)后復(fù)發(fā)的影響

根據(jù)上述ROC曲線分析結(jié)果（最佳判讀值為2.14），將肝癌組織Mortalin相對表達(dá)水平>2.14的患者納入高表達(dá)組（n=69），而將肝癌組織Mortalin相對表達(dá)水平<2.14的患者納入低表達(dá)組（n=81）。兩組患者的一般資料在年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤數(shù)量、手術(shù)方式、病毒感染及有無接受術(shù)后化療等方面無顯著差異（P>0.05）（表1）。高表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有57例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)（3年無復(fù)發(fā)生存率為17.39%）;低表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有10例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)（3年無復(fù)發(fā)生存率為87.65%）。Kaplan-Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組3年無復(fù)發(fā)生存率明顯優(yōu)于高表達(dá)組（P<0.01，兩組間復(fù)發(fā)風(fēng)險比：10.9915，95%可信區(qū)間：6.6338～18.2119）（圖2）。

3 討論

肝癌是我國目前最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌的發(fā)病率約為26.63/10萬，每年死于肝癌的人數(shù)約為31.6萬，占據(jù)全世界肝癌死亡人數(shù)的一半以上[1]。手術(shù)切除是除肝移植之外針對肝癌目前最有效的治療手段[4]。然而肝癌手術(shù)切除后仍有非常高的復(fù)發(fā)率，導(dǎo)致長期生存率不甚理想，給家庭社會帶來巨大的精神損失和壓力[5，6]。因此需要深入探索肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的機(jī)制及危險因素，找到預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的靶點(diǎn)，以改善肝癌術(shù)后長期生存。

隨著分子生物學(xué)及人類基因組學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)的發(fā)展，越來越多的腫瘤分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)。Mortalin是熱休克蛋白70族蛋白的一種，又被稱作GRP75，最早是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，廣泛存在細(xì)胞器內(nèi)。Mortalin已被證實(shí)在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤內(nèi)表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平直接與預(yù)后相關(guān)，已成為腫瘤預(yù)后的重要預(yù)測因子[12-15]。同時，Mortalin還被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中起到介導(dǎo)化療耐藥、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等作用，因此Mortalin過表達(dá)使得腫瘤預(yù)后進(jìn)一步惡化[16-20]。

近年來關(guān)于Mortalin在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究日漸受到重視。有學(xué)者利用蛋白組學(xué)對攜有丙肝病毒的肝癌患者的肝癌組織進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在此類肝癌組織中Mortalin的表達(dá)較正常肝組織增高[21]。為研究肝癌組織Mortalin表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系，有研究者將術(shù)后1年內(nèi)早期復(fù)發(fā)的肝癌患者肝癌Mortalin表達(dá)水平與1年后復(fù)發(fā)的患者比較，發(fā)現(xiàn)在肝癌術(shù)后1年內(nèi)早期復(fù)發(fā)的患者M(jìn)ortalin表達(dá)水平要顯著高于1年后復(fù)發(fā)的患者，同時還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系中其表達(dá)亦升高。從而提示Mortalin在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面可能發(fā)揮重要作用，與腫瘤侵襲密切相關(guān)[22]。

本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織Mortalin表達(dá)水平對術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的AUC為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，將患者按肝癌組織Mortalin表達(dá)水平分類為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Kaplan-Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組3年無復(fù)發(fā)生存率明顯優(yōu)于高表達(dá)組（P<0.01）。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Mortalin基因表達(dá)量與肝癌細(xì)胞增殖基因、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)基因直接相關(guān)[23，24]。而通過放療聯(lián)合局部熱療可有效降低Mortalin基因表達(dá)量，從而抑制肝細(xì)胞增殖及EMT，改善患者預(yù)后[25]。這可能是由于EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的第一步，腫瘤上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接（基地極性）并獲得遷移、侵襲基底膜的能力[26]。眾多惡性腫瘤研究已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞發(fā)生EMT后失去上皮標(biāo)志蛋白并獲得間質(zhì)標(biāo)志蛋白，導(dǎo)致其黏著連接破壞并出現(xiàn)局部或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[27]。EMT參與惡性腫瘤細(xì)胞血管滲出、腫瘤轉(zhuǎn)移定植等眾多過程，EMT活性與腫瘤惡性程度高度相關(guān)[28]。我們可以推測通過降低Mortalin水平抑制肝癌細(xì)胞EMT能顯著改善肝癌預(yù)后。綜上所述，肝癌組織Mortalin表達(dá)水平與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，Mortalin表達(dá)水平升高則預(yù)示著術(shù)后早期復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳，因此Mortalin可能是預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的有效治療靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤，2017，（26）：1-7.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會醫(yī)政醫(yī)管局.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）[J].中華消化外科雜志，2017，7（16）：635-647.

[3] 王黎君，殷鵬，劉韞寧，等.1990年與2013年中國人群肝癌疾病負(fù)擔(dān)研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2016，6（37）：758-762.

[4] 陳孝平.《肝細(xì)胞癌外科治療方法的選擇專家共識》解讀[J].中華外科雜志，2017，66（55）：7-10.

[5] 院存珍，樊晨.原發(fā)性肝癌的外科治療進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2016，2（19）：155-157.

[6] 鄧小斌.肝癌肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)再手術(shù)治療價值及術(shù)式選擇[J].臨床外科雜志，2017，6（25）：429-430.

[7] Niu X，Su L，Qi S，et al. GRP75 modulates oncogenic Dbl-driven endocytosis derailed via the CHIP-mediated ubiquitin degradation pathway[J]. Cell Death & Disease，2018，9（10）：971.

[8] Mazkereth N，Rocca F，Schubert JR，et al.Complement triggers relocation of Mortalin/GRP75 from mitochondria to the plasma membrane[J].Immunobiology，2016，221（12）：1395-1406.

[9] Hoter A，El-Sabban ME，Naim HY.The HSP90 family：Structure，regulation，function，and implications in health and disease[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（9）：E2560.

[10] Park SH，Baek KH，Shin I.Subcellular Hsp70 inhibitors promote cancer cell death via different mechanisms[J]. Cell Chemical Biology，2018，25（10）：1242-1254 e1248.

[11] Tang C，Shen J，F(xiàn)eng W，et al.Combination therapy of radiofrequency ablation and transarterial chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma：A retrospective study[J].Medicine，2016，95（20）：e3754.

[12] Cui X，Li Z，Piao J，et al. Mortalin expression in pancreatic cancer and its clinical and prognostic significance[J].Human Pathology，2017，64（17）：171-178.

[13] Sun J，Che SL，Piao JJ，et al. Mortalin overexpression predicts poor prognosis in early stage of non-small cell lung cancer[J].Tumour Biology，2017，39（3）：1010428317 695918.

[14] Xu M，Jin T，Chen L，et al. Mortalin is a distinct bio-marker and prognostic factor in serous ovarian carcinoma[J].Gene，2019，696（5）：63-71.

[15] Kang Q，Zou H，Yang X，et al. Characterization and prognostic significance of mortalin，Bcl-2 and Bax in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Oncology Letters，2018，15（2）：2161-2168.

[16] Abunimer AN，Mohammed H，Cook KL，et al.Mitochondrial autophagosomes as a mechanism of drug resistance in breast carcinoma[J]. Ultrastructural Pathology，2018，42（2）：170-180.

[17] Krawczyk Z，Gogler-Piglowska A，Sojka DR，et al.The role of heat shock proteins in cisplatin resistance[J].Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry，2018，18（15）：2093-2109.

[18] Na Y，Kaul SC，Ryu J，et al.Stress chaperone mortalin contributes to epithelial-mesenchymal transition and cancer metastasis[J]. Cancer Research，2016，76（9）：2754-2765.

[19] Rozenberg P，Ziporen L，Gancz D，et al.Cooperation between Hsp90 and mortalin/GRP75 in resistance to cell death induced by complement C5b-9[J]. Cell Death & Disease，2018，9（2）：150.

[20] Kang Q，Cai JB，Dong RZ，et al. Mortalin promotes cell proliferation and epithelial mesenchymal transition of intrahepatic cholangiocarcinoma cells in vitro[J]. Journal of Clinical Pathology，2017，70（8）：677-683.

[21] Kuramitsu Y，Nakamura K. Current progress in proteomic study of hepatitis C virus-related human hepatocellular carcinoma[J].Expert Review of Proteomics，2005，2（4）：589-601.

[22] Yi X，Luk JM，Lee NP，et al. Association of mortalin （HSPA9） with liver cancer metastasis and prediction for early tumor recurrence[J]. Molecular & Cellular Proteomics：MCP，2008，7（2）：315-325.

[23] 陳靜，劉文斌，莢衛(wèi)東，等.熱休克蛋白75在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用[J].中華肝膽外科雜志，2014，20（1）：51-55.

[24] Chen J，Liu WB，Jia WD，et al.Overexpression of Mortalin in hepatocellular carcinoma and its relationship with angiogenesis and epithelial to mesenchymal transition[J].International Journal of Oncology，2014，44（1）：247-255.

[25] 李東.調(diào)強(qiáng)放療聯(lián)合局部熱療對晚期肝癌病灶中Mortalin表達(dá)的影響及其與細(xì)胞增殖、EMT的關(guān)系[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018，20（24）：1842-1845.

[26] Goossens S，Vandamme N，Van Vlierberghe P，et al. EMT transcription factors in cancer development re-evaluated：Beyond EMT and MET[J]. Biochimica et Biophysica Acta Reviews on Cancer，2017，1868（2）：584-591.

[27] Saitoh M.Involvement of partial EMT in cancer progression[J]. Journal of Biochemistry，2018，164（4）：257-264.

[28] Cho ES，Kang HE，Kim NH，et al.Therapeutic implications of cancer epithelial-mesenchymal transition （EMT）[J].Archives of Pharmacal Research，2019，42（1）：14-24.

（收稿日期：2019-09-06）