何光勝，付 彪，徐 詩(shī)，趙述淼，梁運(yùn)祥，胡遠(yuǎn)亮，

(1.廣東楊興農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 湛江 524100；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性?xún)?nèi)生芽胞桿菌，菌落形狀不規(guī)則，呈奶白色圓形，菌體形態(tài)直線(xiàn)或彎曲狀，中間部分略有突出，周?chē)斜廾?，能運(yùn)動(dòng)，端圓，細(xì)胞直徑(0.6～1.2)×(3.0～7.0)μm[1].1933年日本科學(xué)家宮入近智首次發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌，1935年成功從人體糞便中分離得到[2]。

研究表明丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生一系列短鏈脂肪酸，這不僅對(duì)腸道內(nèi)的致病菌具有抑制作用，還能促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌的生長(zhǎng)，有益于腸道健康[3～4]。丁酸梭菌可用于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，防治動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉，且丁酸梭菌產(chǎn)芽胞，與非芽胞類(lèi)微生物相比其性能更加穩(wěn)定，耐儲(chǔ)存，展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景，因此相關(guān)研究備受關(guān)注[5]。丁梭梭菌的腸道耐受能力與益生特性是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本文通過(guò)比較2株丁酸梭菌的特性，為益生菌的篩選與評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) M1、Q1，大腸桿菌(Escherichiacoli)K88和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

梭菌增殖培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)：酵母浸膏3 g，牛肉浸膏10 g，胰蛋白胨 10 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化鈉5 g，三水合乙酸鈉3 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，0.5%美藍(lán)0.2 mL，蒸餾水1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基以1.5%～2.0%加入瓊脂，調(diào)節(jié)pH至7.1 ± 0.1，115°C、20 min滅菌備用。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基以1.5%～2.0%加入瓊脂， 調(diào)pH至 7.2～7.4，121°C、15 min滅菌。

1.2 丁酸梭菌活化

將保藏的菌種分別接至RCM液體培養(yǎng)基中，37°C靜置厭氧培養(yǎng)48 h，水浴80°C、10 min，取0.1 mL轉(zhuǎn)接至9.9 mL RCM液體培養(yǎng)基試管中，37°C靜置厭氧培養(yǎng)16 h.

1.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH曲線(xiàn)的測(cè)定

取25支裝有9.9 mL RCM的液體培養(yǎng)基試管，分別吸取活化菌株0.1 mL，37°C厭氧培養(yǎng)。每隔2 h，分別測(cè)OD650值和pH值，每次取3支重復(fù)試管，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH曲線(xiàn)。

1.4 耐人工胃液能力

配制人工胃液調(diào)至pH3.0，滅菌備用。取1 mL活化的菌液，離心洗滌芽胞懸液，接種至9 mL人工胃液中，37°C靜置培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)，定期采樣，用試管法檢測(cè)活菌數(shù)量，計(jì)算存活率。

試管計(jì)數(shù)法：取1 mL丁酸梭菌發(fā)酵液，進(jìn)行梯度稀釋。18 mm的試管倒入15 mL滅菌的RCM半固體培養(yǎng)基(0.6%瓊脂粉)，當(dāng)溫度降低到55°C左右，取100 μL稀釋液，加入到半固體培養(yǎng)基中，混合均勻，并加入2～3 mL石蠟密封，培養(yǎng)37°C、16 h，取出計(jì)數(shù)。

1.5 耐豬膽鹽能力

取1 mL活化的菌液，離心洗滌芽胞懸液接種于含0.1%、0.3%和0.5%豬膽鹽的9 mL RCM液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)，3 h后分別用試管計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)量，計(jì)算存活率。

1.6 耐藥性實(shí)驗(yàn)

分別取0.1 mL活化菌液接種至含抗生素的RCM培養(yǎng)基中，每組3個(gè)重復(fù)，置37°C厭氧培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況。

1.7 腸道致病菌體外拮抗實(shí)驗(yàn)

致病菌活化：將豬大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌甘油管分別轉(zhuǎn)接于LB斜面培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)48 h后，取一環(huán)菌接種于9.9 mL RCM液體培養(yǎng)基中，厭氧靜置培養(yǎng)16 h.

單獨(dú)培養(yǎng)：取13支裝有9.9 mL的RCM液體培養(yǎng)基，取0.1 mL活化好的致病菌液接種到試管中，置于37°C靜置培養(yǎng)，定期采樣，測(cè)定活菌數(shù)和pH值。

丁酸梭菌和致病菌混合培養(yǎng)：取13只裝有9.8 mL RCM液體培養(yǎng)基試管，各取0.1 mL活化好的丁酸梭菌和致病菌菌液接種到試管中，置于37°C靜止厭氧培養(yǎng)，定期采樣，測(cè)定活菌數(shù)和pH值，并與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的測(cè)量值對(duì)比。

致病菌計(jì)數(shù)采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，選用LB平板， 37°C培養(yǎng)48 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，在有氧情況下無(wú)法長(zhǎng)出，因此計(jì)算結(jié)果為致病菌菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH曲線(xiàn)的測(cè)定

由圖1可知，2株丁酸梭菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，均在0～10 h生長(zhǎng)平緩，處于遲緩期，12～16 h生長(zhǎng)旺盛，吸光值快速上升，處于對(duì)數(shù)期，16 h后生物量趨于平穩(wěn)，處于穩(wěn)定期。M1的最終生物量比Q1略高；2株丁酸梭菌的pH變化趨勢(shì)也大致相同，最終pH均在4.5左右，這是由于丁酸梭菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生丁酸和乙酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致對(duì)數(shù)期pH迅速下降。

時(shí)間/Time(h)

時(shí)間/Time(h)

圖1 丁酸梭菌M1(A)和Q1(B)生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH曲線(xiàn)

2.2 耐人工胃液能力

丁酸梭菌進(jìn)入腸道內(nèi)發(fā)揮作用首先必須耐受低pH值的胃液環(huán)境，人體胃液pH通常在3.0左右，食物在胃內(nèi)停留的時(shí)間為1～3 h.由表1可以看到，2株菌對(duì)pH 3.0的人工胃液的耐受能力有一定差別，將0 h的丁酸梭菌活菌數(shù)定義為100%，3 h后菌株M1存活率仍在80%以上，菌株Q1存活率僅為21.4%.

表1 丁酸梭菌對(duì)pH 3.0人工胃液的耐受性

2.3 耐豬膽鹽能力

丁酸梭菌通過(guò)胃液進(jìn)入小腸，它能在腸道中存活并發(fā)揮作用，必須具有一定的膽鹽耐受能力，人體腸道膽鹽濃度一般為0.03%～0.3%.從表2知，豬膽鹽濃度越高，丁酸梭菌存活率越低， 0.3%的豬膽鹽濃度下，存活率均為10%以上，表明這2株菌對(duì)豬膽鹽的耐受能力良好，菌株M1比菌株Q1的膽鹽耐受能力強(qiáng)。

表2 丁酸梭菌對(duì)不同豬膽鹽濃度的耐受性

2.4 耐藥性

由表3可知，丁酸梭菌Q1和M1對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐受性大致相同，均對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)紅霉素耐受能力較差，對(duì)氯霉素、慶大霉素和卡那霉素耐受能力較強(qiáng)。

表3 丁酸梭菌對(duì)抗生素耐受性

注：“+++”生長(zhǎng)良好，“++”生長(zhǎng)一般，“+”生長(zhǎng)，“-”不生長(zhǎng)。

2.5 對(duì)腸道致病菌體外拮抗能力

分別將2菌株與金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)， 16 h后金黃色葡萄球菌數(shù)量明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)，數(shù)量差距達(dá)到2個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明這兩個(gè)菌株都能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)(圖2)。金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中不產(chǎn)酸性物質(zhì)，而丁酸梭菌產(chǎn)丁酸和乙酸等有機(jī)酸，這使得混合培養(yǎng)時(shí)的pH值降低，從而抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。分別將2菌株與大腸桿菌K88混合培養(yǎng)，24 h后大腸桿菌K88數(shù)量明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)，數(shù)量差距達(dá)到2個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明這2個(gè)菌株都能顯著抑制大腸桿菌K88的生長(zhǎng)由(圖3)。

時(shí)間/Time(h)

圖2 丁酸梭菌對(duì)金黃色葡萄球菌的拮抗作用

時(shí)間/Time(h)

圖3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌K88的拮抗作用

3 討論

本文對(duì)2株丁酸梭菌Q1和M1的益生特性進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)2株菌生長(zhǎng)性能和抗藥性相近，但耐胃酸、耐膽鹽能力有一定的差別。丁酸梭菌M1與Q1在pH 3.0人工模擬胃液中保持3 h，存活率分別為87.6%、21.4%，在0.5%豬膽鹽濃度培養(yǎng)基中保持3 h，存活率分別為11.0%、8.1%.丁酸梭菌B1在pH 2.0的人工模擬胃液中3 h后存活率在90%以上，在0.5%豬膽鹽濃度培養(yǎng)基中3 h后存活率在30%以上[6]。丁酸梭菌ZJUCB在pH 2.0的人工模擬胃液中3 h后存活率為25%左右，在0.5%豬膽鹽濃度培養(yǎng)基中3 h后存活率在60%以上[7]。這些結(jié)果說(shuō)明，不同的丁酸梭菌，耐胃酸、耐膽鹽能力有較大差別，即使被鑒定是丁酸梭菌，也不一定具備飼料添加劑應(yīng)用前景，耐胃酸和耐膽鹽能力應(yīng)作為評(píng)價(jià)飼用丁酸梭菌的重要指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)，2株丁酸梭菌都能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K88的生長(zhǎng)，與單獨(dú)培養(yǎng)病原菌相比，混合培養(yǎng)時(shí)金黃色葡萄球菌與大腸桿菌K88數(shù)量明顯下降。曹廣添等[8]體外研究表明，丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌具有抑制作用，對(duì)乳酸桿菌和雙歧桿菌有促進(jìn)作用。目前，丁酸梭菌抑制某些致病菌的作用機(jī)理至今仍不明確，大部分學(xué)者認(rèn)為是丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)降低了pH，從而抑制病原微生物的生長(zhǎng)[9]。丁酸梭菌抑制病原菌生長(zhǎng)及作用機(jī)理，應(yīng)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

本文通過(guò)比較2株丁酸梭菌的益生特性，發(fā)現(xiàn)不同菌株性質(zhì)差別較大，丁酸梭菌M1具有更好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)為益生菌的篩選和評(píng)價(jià)提供參考。