王子豪 胡何節(jié) 方征東 王曉天 孫小杰 葛新寶 程 燦

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院血管外科，安徽 合肥 230001

閉塞性動脈硬化（arteriosclerosis obliterans，ASO）是一種全身性疾病，國外超過75 歲人群中ASO 發(fā)病率近20%，中國老年群體中發(fā)病率超過10%，隨著社會老齡化階段進展，其趨勢仍在不斷升高[1]。當ASO 涉及腹主動脈及其遠側主干動脈時，引起下肢慢性缺血，稱為下肢動脈硬化癥（lower extremity atherosclerosis disease，LEAD）。LEAD 的發(fā)生受不同因素影響，包括環(huán)境、飲食或基因等。其發(fā)病機制至今仍不完全明確，涉及不同假說，包括脂代謝紊亂、內(nèi)膜損傷[2]、血流剪切力等。隨著研究不斷進展表明，在動脈硬化的發(fā)生及發(fā)展中，免疫的作用始終貫穿其中。調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）與調(diào)節(jié)性B 細胞（regulatory B cells，Breg）是一種起負性調(diào)節(jié)作用的免疫細胞，Treg 數(shù)量的高低與局部動脈硬化的進程呈負相關性[3]，外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR），是易獲得的一項數(shù)據(jù)。本研究探討LEAD 患者外周血免疫功能及炎性指標與LEAD 嚴重程度的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1月至2019 年8月就診于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院的LEAD 患者45例，按照疾病臨床嚴重程度，將其分為間歇性跛行組（Rutherford 1～3 級）24例，嚴重肢體缺血組（Rutherford 4～6 級）21例，臨床分級參考Rutherford分級[6]。排除ABI ＞1.0、明確診斷的活動性感染、自身免疫性疾病、血液病、接受慢性免疫治療及激素治療、肝腎功能不全、4 周內(nèi)出現(xiàn)心梗及腦卒中的患者。

1.2 方法

入院患者根據(jù)其臨床癥狀進行Rutherford分級，分級由2 位醫(yī)師進行，如出現(xiàn)差異則請第3 位醫(yī)師進行評定。記錄入院患者性別、年齡、有無吸煙史及飲酒史，有無高血壓、糖尿病、冠心病、腦梗塞病史?；颊呷朐和晟撇⒂涗浧浒准毎嫈?shù)、肌酐、尿酸、中性粒細胞絕對值、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值，并由此計算NLR，抽取患者晨起空腹血2 ml，采用流式細胞術測定其外周血Treg/CD4+T 細胞及Breg/B 細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；Breg/B 細胞和NLR 采用四分位間距M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)曼-惠特尼U 檢驗；相關性采取Pearson相關分析，單因素分析顯示有意義的納入Logistic回歸分析，P＜0.05 時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

45例LEAD 患者，男性35例，女性10例。兩組患者一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 免疫功能比較

間歇性跛行組患者外周血Treg 細胞/CD4+T 細胞、Breg 細胞/B 細胞均高于嚴重肢體缺血組患者，NLR 低于嚴重肢體缺血組患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

2.3 患者外周血免疫細胞與Rutherford分級相關性分析

Treg/CD4+T 細胞與LEAD 患者Rutherford分級無相關性（r=－0.263，P=0.093），NLR 與LEAD 患者Rutherford分級呈正相關（r=0.357，P=0.016），Breg/B 細胞與LEAD患者Rutherford分級呈負相關（r=－0.297，P=0.047）。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

表2 兩組患者外周血免疫細胞比較

2.4 嚴重下肢缺血多因素分析

NLR 是LEAD 患者獨立危險因素，見表3。

表3 嚴重下肢缺血多因素Logistic 回歸分析

3 討論

動脈粥樣硬化是一種進行性疾病，隨疾病逐步進展，會誘發(fā)一系列諸如冠心病、腦卒中、外周血管病變的血管相關疾病。LEAD 通常早期癥狀不明顯， 隨疾病階段進展，逐漸出現(xiàn)皮膚發(fā)涼、感覺異常、間歇性跛行， 繼則出現(xiàn)靜息痛、皮膚營養(yǎng)障礙， 甚至潰瘍、壞疽， 最終導致截肢甚至危及生命[1]。當累及下肢動脈且具有靜息痛（2 周以上）、破潰時，稱為嚴重肢體缺血（critical limb ischemia，CLI）。研究證實，動脈粥樣硬化不僅僅是動脈壁內(nèi)脂質(zhì)堆積的結果，血管損傷后所導致的一系列慢性炎性反應及免疫反應，包括固有免疫和特異性免疫，對其的發(fā)生發(fā)展亦起著重要作用。通常認為，當血管壁脂質(zhì)堆積或動脈壁損傷后，會觸發(fā)固有及特異性免疫。單核/巨噬細胞、中性粒細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞是動脈粥樣硬化的主要參與者。本研究顯示外周血中中性粒細胞、Treg及Breg 變化與動脈硬化嚴重程度有關系。

Treg 被認為是一種免疫調(diào)節(jié)細胞，通過TGF-β， IL-10， IL-35 等抗炎因子以及細胞接觸起抑制作用，人類動脈粥樣硬化斑塊中約包含1%～5%具有抗動脈硬化功能的Treg[10]，在小鼠模型中，誘導Treg 生成可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，而Treg 的耗竭則可加速動脈粥樣硬化的發(fā)展[11]。研究表明，健康患者與動脈硬化患者外周血Treg表達比例不同[4]，本研究發(fā)現(xiàn)，外周血Treg 比例在間歇性跛行患者與CLI 患者存在顯著差異，間歇性跛行患者外周血Treg 百分比顯著高于CLI 患者，說明隨疾病進展，Treg 進一步耗竭，患者體內(nèi)細胞免疫調(diào)節(jié)失調(diào)，導致免疫功能紊亂可能是LEAD 加重的因素之一。

Breg 存在于脾臟中，約占B 細胞總數(shù)的不到1%，具有免疫調(diào)節(jié)特性，且有助于激活Treg[15]。Breg 通過在其表面分泌抗炎因子IL-10、轉化生長因子(TGF)-β、促凋亡因子和IgM 抗體來促進免疫抑制。研究表明，在Apoe—/— 小鼠中，調(diào)節(jié)性B 淋巴細胞的減少伴隨著IL-10 的減少和主動脈動脈粥樣硬化程度的增加[13]。此外，使用中和抗體抑制IL-10，或移植IL-10 缺陷的B 淋巴細胞，均可消除Breg 的抗動脈粥樣硬化作用[14]。我國關于外周血中Breg 與動脈硬化的研究較少，大多集中于與腫瘤及自身免疫性疾病關系的研究上。本研究表明，外周血Breg 比例在間歇性跛行患者與CLI 患者存在顯著差異，且與LEAD 患者Rutherford分級呈負相關，說明在LEAD 的進程中存在全身體液免疫失調(diào)，且與上述小鼠研究結果相一致。

中性粒細胞是公認的急性炎性反應的第一道防線，但在動脈粥樣硬化的病理生理中，其作用往往被忽視。近年來對動脈粥樣硬化機制的研究進展表明，中性粒細胞是動脈粥樣硬化形成的重要因素之一。中性粒細胞是通過某些趨化因子，特別是由活化的血小板產(chǎn)生的趨化因子，參與到動脈粥樣硬化病變中來的。其首先與選擇素、整合素等相互作用， 以使單核細胞在動脈硬化病變處聚集，此外，這些蛋白可以激活巨噬細胞，并促進泡沫細胞的形成[7]。因此，中性粒細胞絕對值可以作為評定動脈硬化嚴重程度的衡量指標，但單一納入中性粒細胞絕對值易受感染、機體脫水等因素影響，因此中性粒細胞與淋巴細胞比值作為一種組合型炎性標志物，整合了細胞及體液免疫兩種途徑，一定程度上回避了單一指標的劣勢?，F(xiàn)已有研究證明，NLR 對于動脈硬化性腦梗死有著積極的評估作用，且與頸動脈的狹窄程度呈正相關[8]，高血壓人群中動脈硬化患者與非動脈硬化患者外周血NLR 不同[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，NLR 與LEAD 患者Rutherford分級呈正相關，患者臨床癥狀愈嚴重，其NLR 值愈高，結合Treg 及Breg與LEAD 嚴重程度關系可知，當患者臨床癥狀越重，機體炎性反應越大，這一結果與NLR 與頸動脈硬化結果相一致。回歸分析提示NLR 是LEAD 患者發(fā)展為CLI 的獨立危險因素，提示炎性反應始終存于LEAD 患者疾病各個階段，炎性反應的進一步加重及免疫調(diào)節(jié)的進一步失調(diào)促進了LEAD 患者疾病的進展，NLR 對于LEAD 疾病的轉歸起到一定預測作用。有研究表明，對高炎性反應的患者進行卡那單抗治療，有效降低了其心腦血管意外事件再發(fā)的風險[9]。因此，針對中性粒細胞參與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制為動脈硬化的治療提供了新思路，但目前沒有研究證實抗炎治療能顯著減輕下肢動脈缺血或減慢抑制下肢動脈粥樣硬化進程。此外，應該注意的是，LEAD 患者常合并下肢破潰處的局部感染，抑制中性粒細胞功能的策略必須謹慎使用，以免產(chǎn)生任何嚴重的不良影響。

綜上所述，LEAD 患者疾病進程中存在著全身免疫調(diào)節(jié)紊亂及慢性炎性反應。隨疾病嚴重程度增加，免疫功能紊亂及炎性反應會進一步加重，Treg 及Breg 的降低可能對LEAD 的進一步加重起著重要作用，未來治療LEAD可以從免疫調(diào)節(jié)及炎性反應控制上切入，但需注意治療所帶來的不良反應。