李盛陶， 王 寧， 高曉冬*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

蛋白質(zhì)的糖基化修飾是真核細(xì)胞翻譯后修飾的主要形式之一，在蛋白質(zhì)折疊，轉(zhuǎn)運(yùn)和定位過程中發(fā)揮著重要作用[1]。 分泌蛋白和細(xì)胞表面蛋白的糖基化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和高爾基體上，主要包括有：N-糖基化[2]、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定化[3]、O-[4]及C-甘露糖基化[5]等4 種修飾。 在ER 腔內(nèi)的甘露糖基化修飾共同存在于上述4 種途徑中，在糖基化修飾過程中起著重要的作用。 ER 腔內(nèi)的甘露糖基化是利用糖基轉(zhuǎn)移酶將甘露糖（Man）從供體多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）轉(zhuǎn)移到受體上，因此Dol-PMan 的合成對(duì)于理解不同種類的蛋白糖基化修飾具有重要的意義[6]。

在所有真核生物中，Dol-P-Man 的合成發(fā)生在ER 胞質(zhì)區(qū)，利用多萜醇磷酸甘露糖合成酶（DPM 合成酶）將Man 從供體鳥苷二磷酸甘露糖（GDP-Man）轉(zhuǎn)移到受體多萜醇磷酸（Dol-P）上[7]。 為了體外酶法合成Dol-P-Man，早期的研究利用酵母細(xì)胞及豬肝破碎后分離微粒體（含ER 成份），制備天然的DPM合成酶， 體外催化GDP-Man 和Dol-P 生成Dol-PMan[8-9]。 隨著酵母DPM 合成酶基因（DPM1）的克隆鑒定[10]，后面的研究采用了重組大量表達(dá)酵母Dpm1用于Dol-P-Man 的合成[11]。但是由于多萜醇（Dolichol）的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜， 含有超過100 個(gè)碳原子的脂肪鏈[12]，因此難以獲得及在體外反應(yīng)中難以溶解等因素進(jìn)一步地限制了Dol-P-Man 的體外合成。 Wilson等發(fā)現(xiàn)植烷醇（Phytanol）作為一個(gè)簡單的結(jié)構(gòu)（含有20 個(gè)碳），能夠替代Dolichol，在體外反應(yīng)中酵母Dpm1 能夠催化植烷醇磷酸（Phy-P）與GDP-Man 形成Phy-P-Man[13]。 但是結(jié)構(gòu)簡單的替代物Phy-PMan 作為供體能否被ER 腔內(nèi)的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（如N-糖基化途徑中的酶Alg3）所識(shí)別并不知道。

為了解決上述存在的問題，本文作者成功地原核表達(dá)并純化了酵母Dpm1，利用簡單的結(jié)構(gòu)Phy-P與GDP-Man 催化合成了Phy-P-Man。 更進(jìn)一步地證明，Phy-P-Man 能夠作為Alg3 的底物用于N-糖基化的研究。

1材料與方法

1.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

原核表達(dá)酵母Dpm1 蛋白質(zhì)重組載體的構(gòu)建如下：首先從NCBI 中下載釀酒酵母DPM1 基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物分別在5′ 端和3′ 端引入BamHI 和EcoRI 酶切位點(diǎn)。以釀酒酵母基因組為模板，擴(kuò)增得到DPM1 PCR 產(chǎn)物， 酶切連接構(gòu)建得到重組載體pET28a-Dpm1。 Dpm1 的突變蛋白質(zhì)采用定點(diǎn)突變重疊PCR 方法引入[14]。 酵母Alg3 蛋白質(zhì)的原核表達(dá)在N 端融合了Mistic 標(biāo)簽，Mistic 的序列參照以前的文獻(xiàn)[15]。載體構(gòu)建如下：首先人工合成Mistic 基因序列， 連接到pET28a 的NdeI 和NheI 酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建載體pET28a-Mistic。釀酒酵母ALG3 基因從釀酒酵母基因組上擴(kuò)增， 連接到載體pET28a-Mistic 的BamHI 和XhoI 酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建載體pET28a-Mistic-Alg3。 所有載體都經(jīng)過測(cè)序確認(rèn)（華大基因）。

1.2 重組蛋白Dpm1 的大量表達(dá)與純化

將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Dpm1 轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）（Thermo Scientific）原核表達(dá)宿主菌，構(gòu)建重組原核表達(dá)宿主菌。挑取單菌落接種于5 mL LB（含Kan50 μg/mL 氯霉素34 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取2 mL 過夜培養(yǎng)的菌液接種于200 mL TB（含Kan、氯霉素）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h，使OD600達(dá)到0.6～0.8，然后轉(zhuǎn)移至16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h 再加入IPTG 使其終濃度達(dá)到0.1 mmol/L, 200 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。 離心收集菌體， 重懸于20 mL A 緩沖液 （25 mmol/L Tris/HCl（pH 8.0）,150 mmol/L NaCl）中，超聲破碎，4000 g、4 ℃離心20 min，棄沉淀，收集上清液20000 g，4 ℃高速離心90 min， 棄上清液， 沉淀重懸于10 mL B緩沖液 （25 mmol/L Tris/HCl （pH 8.0）, 150 mmol/L NaCl， 體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100）4 ℃放置30 min后12000 g 離心30 min，收集上清用于純化。 純化步驟如下：HisTrap HP 1 mL 親和層析柱（GE）先用10 倍體積的B 液流速1 min/mL 平衡后，上樣10 mL左右上清液，然后分別用含20、60、500 mmol/L 咪唑的B 液各10 mL 洗柱子， 分別收集與離心管中，取樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。

1.3 重組蛋白Mistic-Alg3 的大量表達(dá)、膜成份制備及western blotting 檢測(cè)

將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Mistic-Alg3 轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）原核表達(dá)宿主菌。 表達(dá)條件與上述Dpm1 一致。 為了制備含有Mistic-Alg3（M-Alg3）蛋白的大腸桿菌膜成份，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的10 mL 重組菌體，重懸于1 mL A 緩沖液中，超聲破碎，4000 g、4 ℃離心20 min，棄沉淀，收集上清液100000 g、4 ℃高速離心60 min， 棄上清液， 沉淀重懸溶解于0.1 mL 緩沖液 （50 mmol/L 2-（N-嗎啉） 乙磺酸（MES） pH 6.5，體積分?jǐn)?shù)30% glycerol），即得到大腸桿菌細(xì)胞膜成分， 蛋白免疫印跡（Western blotting）進(jìn)行檢測(cè)M-Alg3 的表達(dá)。 具體操作如下：取10 μg 細(xì)胞膜成份進(jìn)行SDS-PAGE， 然后轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。 5 g/dL 的脫脂牛奶（上海生工）封閉1 h后，2000 倍 稀 釋 的 一 抗 （anti-His Mouse mAb,TRANS）孵育1 h，TBST 洗滌3 次。 5000 倍稀釋的二抗（HRP-Goat Anti-Mous lgG, TRANS）孵育1 h，TBST 洗滌3 次后，ECL 顯色試劑（BIO-RAD）顯色，放入ImageQuant LAS 4000 凝膠成像系統(tǒng)（GE）中曝光觀察結(jié)果。

1.4 重組蛋白Dpm1 的酶活檢測(cè)

Dpm1 的底物phytanyl-phosphate（Phy-P）根據(jù)早期的文獻(xiàn)和作者之前的文章化學(xué)合成[16-17]。 標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)條件如下 （50 μL 體系）：50 mmol/L Tris/HCl （pH 7.5），10 mmol/L MgCl2， 體積分?jǐn)?shù)1%NP-40，20 mmol/L Phy-P，50 mmol/L GDP-Man （Sigma） 和2 mg/mL 純化的Dpm1 蛋白。 反應(yīng)在30 ℃下孵育10 h。 酶的活性檢測(cè)用薄層層析方法（TLC）檢測(cè)，具體如下：反應(yīng)結(jié)束后，用毛細(xì)管取少量點(diǎn)于硅膠板（Merck）， 吹干后在氯仿/甲醇/水（6.5∶3.5∶0.4, 體積比）的展開劑中層析。 結(jié)束后，浸于乙醇/硫酸（19∶1,體積比）溶液中，然后加熱顯色。

1.5 重組蛋白M-Alg3 的酶活檢測(cè)

重組蛋白M-Alg3 的底物Phy-PP-GlcNAc2-Man5（Phy-PP-M5） 在我們之前的文章中合成[17-18]。標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)條件如下 （60 μL 體系）： 14 mmol/L MES（pH 6.0），4 mmol/L potassium citrate，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MnCl2，1 mmol/L sucrose，50 μmol/L Phy-PP-M5，2 mmol/L Phy-P-Man， 體積分?jǐn)?shù)0.05%NP-40 和20 mg/mL 的M-Alg3 膜成份。反應(yīng)在30 ℃下孵育12 h。 反應(yīng)結(jié)束后加入0.2 mL 濃度為20 mmol/L 的HCl 于100 ℃下酸解1 h，釋放糖鏈與脂肪鏈Phytanol。 酸解產(chǎn)物12000 g 離心1 min，上清液通過1 mL 固相萃取填料Supelclean ENVICarb Slurry（Sigma）進(jìn)行純化，糖鏈成分用3 mL 體積分?jǐn)?shù)25%的乙腈洗脫后冷凍干燥。 最終得到的純化糖鏈溶解于40 μL 的純水中，通過超效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000 UPLC（Thermo Scientific）自動(dòng)進(jìn)樣1 μL 到氨基色譜柱 （Waters Acquity UPLC BEH Amide Column 1.7 μm 2.1 mm×100 mm）中，乙腈線性梯度洗脫（溶液A： 乙腈；B： 水； 洗脫條件（體積分?jǐn)?shù)）： 0～2 min, 20% B；2～15 min, 20%～50%B；15%～18 min；50% B；流速： 0.2 mL/min）分離底物與產(chǎn)物。 流出液通過ESI-MS 儀器TSQ Quantum Ultra（hermo Scientific）步檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量（離子模式下掃描400～1600 m/z 范圍）

2結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白Dpm1 的純化及活性檢測(cè)

基于多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）在ER 糖基化4 種修飾中的重要作用， 本研究將利用酵母Dpm1 進(jìn)行酶法合成， 并采用結(jié)構(gòu)簡單的Phytanol（含有20 個(gè)碳），替代Dolichol（含有100 個(gè)碳以上）（圖1）。

圖1 Dpm1 催化生產(chǎn)Phy-P-Man 的反應(yīng)示意圖Fig. 1 Yeast Dpm1 catalyzes the transfer of mannose from GDP-Man to Phy-P to produce Phy-PMan

首先構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Dpm1，轉(zhuǎn)入Rosetta DE3）大腸桿菌中，低溫過夜誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)菌體破碎提取細(xì)胞膜成份，溶解于去污劑Triton X-100，利用鎳親和層析純化。 對(duì)500 mmol/L 咪唑洗脫液SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖2（a）顯示3×104左右，有一條明顯的條帶，與Dpm1 預(yù)期的大小相一致，成功實(shí)現(xiàn)了Dpm1 的純化。 接下來，利用純化的Dpm1催化Phy-P 與GDP-Man 形成Phy-P-Man。 如圖2(b)的TLC 結(jié)果所示，底物Phy-P 的比移值（Rf）為0.64（條帶1），在加入Dpm1 后Rf 變?yōu)?.58（條帶2）。Rf的降低是由于親水性的Man 基團(tuán)加入到底物中形成了產(chǎn)物Phy-P-Man 導(dǎo)致極性變大，從而在展開劑中遷移率變慢。 此結(jié)果說明原核表達(dá)純化的Dpm1 活性很高， 能完全催化Phy-P 生成Phy-PMan。

圖2 釀酒酵母Dpm1 的純化及活性檢測(cè)Fig. 2 Purification and activity detection of yeast Dpm1

2.2 Dpm1 的保守性模體 （motif） DXD 為活性所必須

前期的文章證明了Dpm1 的酶活依賴于Mg2+的加入[19-20]。 目前，大量的研究表明采用GT-A 方式折疊的糖基轉(zhuǎn)移酶含有DXD motif，2 個(gè)天冬氨酸能夠與Mg2+結(jié)合發(fā)揮催化功能[21]。 我們通過carbohydrate active enZyme（CAZy）數(shù)據(jù)庫檢索，Dpm1 屬于GT2類，采用GT-A 方式折疊（http：//www. cazy.org）。 我們因此推測(cè)Dpm1 依賴于Mg2+的原因可能存在DXD motif。 接下來，對(duì)不同物種來源的Dpm1 進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)保守性的DXD motif（圖3（a）），在酵母Dpm1 的95-97 位氨基酸序列上。為了驗(yàn)證酵母Dpm1 的DXD motif 的重要作用， 我們構(gòu)建了D95A 和D97A2 個(gè)突變，在大腸桿菌中進(jìn)行了純化（圖3（b）），并測(cè)定了它們的活性。 TLC 結(jié)果如圖3（c）所示，D95A（條帶1）和D97A（條帶2）相對(duì)于野生型（WT）完全喪失了活性，說明了DXD motif對(duì)Dpm1 活性的重要作用。更進(jìn)一步地，與以前的報(bào)告一致， 當(dāng)在野生型Dpm1 的反應(yīng)中不加Mg2+同樣地喪失了活性（條帶3）。 因此，推測(cè)DXD motif 在Dpm1 的作用可能和別的GT-A 類糖基轉(zhuǎn)移酶一樣能夠與Mg2+結(jié)合參與催化功能。

圖3 Dpm1 的DXD motif 突變蛋白的純化及活性檢測(cè)Fig.3 Purification and activity detection of Dpm1 mutants in DXD motif

2.3 Dpm1 的產(chǎn)物Phy-P-Man 能夠被糖基轉(zhuǎn)移酶Alg3 催化

通過純化的Dpm1 合成了Phy-P-Man，但能否替代Dol-P-Man 應(yīng)用于ER 腔內(nèi)的甘露糖基化修飾并不清楚。 為了弄清上述問題，選擇了N-糖基化途徑中以Dol-P-Man 為底物供體的酶Alg3 作為研究對(duì)象。 糖基轉(zhuǎn)移酶Alg3 能夠催化Dol-PPGlcNAc2 -Man5 和Dol -P -Man 生 成Dol -PP -GlcNAc2-Man6[22]。 為了驗(yàn)證Alg3 能否以Phy-PMan 為底物供體，利用實(shí)驗(yàn)室前期合成的Alg3 的替代底物Phy-PP-GlcNAc2-Man5（Phy-PP-M5），并表達(dá)Alg3 蛋白進(jìn)行體外反應(yīng)（圖4）。

圖4 Alg3 催化Phy-PP-M5 與Phy-P-Man 生成Phy-PP-M6 的反應(yīng)示意圖Fig. 4 Alg3 catalyzes the transfer of mannose from Phy-P-Man to Phy-PP-M5 to produce Phy-PP-M6

首先，嘗試原核表達(dá)釀酒酵母Alg3，由于Alg3為多跨膜域蛋白質(zhì)，在大腸桿菌中容易降解，因此在N 端融合了促進(jìn)真核膜蛋白表達(dá)的Mistic 標(biāo)簽（M-Alg3）[15]。 圖5 的Western blotting 結(jié)果顯示相對(duì)于空載對(duì)照（條帶1）在6.5×104左右處，有一條明顯的條帶（條帶2），與M-Alg3 預(yù)期的大小相一致，從而證明M-Alg3 成功的在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。

圖5 酵母重組蛋白M-Alg3 的原核表達(dá)Western blotting 圖Fig.5 Western blot analysis of expression of yeast M-Alg3

接下來， 利用含有重組蛋白M-Alg3 的大腸桿菌膜成份催化Phy-PP-M5 與Phy-P-Man， 反應(yīng)結(jié)束后酸解去掉脂肪鏈部分， 純化糖鏈后LC-MS 分析結(jié)果。 如圖6（a）所示，與空載大腸桿菌膜成份比較， 含有重組蛋白M-Alg3 的大腸桿菌膜成份催化后多了一組峰。 ESI-MS 確證了2 組峰分別起源于底物Phy-PP-M5 （14.6，14.8） 和產(chǎn)物Phy-PP-M6（15.4，15.5）（圖6（b））。 綜上證明Phy-P-Man 能夠被Alg3 所催化應(yīng)用到N-糖基化途徑研究。

圖6 Phy-P-Man 用于重組蛋白M-Alg3 的催化反應(yīng)Fig. 6 Activity detection of recombinant M-Alg3 using Phy-P-Man as a donor

3結(jié) 語

Dpm1 為所有真核生物的必須基因，人體Dpm1發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的先天性糖基化缺陷綜合癥（CDG）[23]。 本研究獲得了純化的酵母Dpm1 蛋白，并鑒定了重要的DXD motif， 有可能跟Mg2+結(jié)合參與催化。 未來的研究將利用純化的蛋白質(zhì)，獲得Dpm1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，解釋其催化機(jī)制，更重要的是，結(jié)構(gòu)信息的獲得對(duì)于理解CDG 發(fā)病的分子機(jī)制具有重要的意義。 另外， 本研究中通過Dpm1 將Phy-P與GDP-Man 催化合成了Phy-P-Man。 Phy-P-Man相對(duì)于天然結(jié)構(gòu)Dol-P-Man 具有結(jié)構(gòu)簡單，水溶性好等優(yōu)點(diǎn)， 并且Phy-P-Man 能夠被Alg3 所催化應(yīng)用到N-糖基化途徑研究。 另外，N-糖基化途徑中Alg3 反應(yīng)后，Alg9 和Alg12 催化的后三步的反應(yīng)形成高甘露糖結(jié)構(gòu)（Dol-PP-M9） 也是以Dol-P-Man為底物供體[2]。 接下來的研究將進(jìn)一步地以Phy-PMan 為底物供體期望能夠體外合成Phy-PP-M9 結(jié)構(gòu)。 同樣的，Phy-P-Man 將來也可應(yīng)用于GPI 錨定化、O-及C-甘露糖基化的研究。 特別是在人體中ER 腔內(nèi)的甘露糖基化修飾途徑中的酶發(fā)生突變將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的先天性糖基化缺陷綜合癥 （CDG）[24]，我們合成的Phy-P-Man 作為這些酶的底物，將會(huì)應(yīng)用于對(duì)CDG 相關(guān)突變酶的活性檢測(cè)乃至開發(fā)出衡量疾病嚴(yán)重程度的定量方法。