葛德鵬， 李 森， 黃 凱， 管 驍

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093）

艾草（Artemisia argyi），別名:香艾、蘄艾、艾蒿。艾草是多年生草本或略成半灌木狀植物，植株有濃烈香氣。 分布廣，除極干旱與高寒地區(qū)外，幾乎遍及全國(guó)[1]。 《本草綱目》記載“蘄艾”可入藥，其植株高大，香氣濃烈；葉厚紙質(zhì)，被毛密而厚。 艾葉是傳統(tǒng)的中醫(yī)藥原料，不僅可改善哮喘、咳嗽，亦能疏通血液[2]，而實(shí)現(xiàn)這些功效的物質(zhì)主要是艾葉揮發(fā)油。 現(xiàn)已有眾多科學(xué)研究表明艾葉揮發(fā)油能快速緩解哮喘等病狀，并且其對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌和假單胞菌等常見(jiàn)的微生物的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用[3]。

但艾葉揮發(fā)油的化學(xué)成分不僅十分復(fù)雜而且種類(lèi)繁多，不同的提取方法會(huì)對(duì)精油的成分造成很大的差異，因此采取適當(dāng)?shù)奶崛l件，最大程度地獲得其中的抑菌成分，是艾葉開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。 目前，對(duì)于艾葉揮發(fā)性油的化學(xué)成分及其生物活性已有一些報(bào)道，但對(duì)提取工藝優(yōu)化研究的報(bào)道較少并且局限于水蒸氣蒸餾、有機(jī)溶劑滲漉法、超臨界CO2等傳統(tǒng)提取法，這些方法在提取艾葉揮發(fā)性油的過(guò)程中，存在揮發(fā)性油有效成分的破壞，有機(jī)溶劑難以分離，操作難度大成本高等問(wèn)題[4-6]。 同時(shí)蒸餾萃?。⊿DE）在揮發(fā)油提取上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，集合水蒸氣蒸餾及溶劑萃取的優(yōu)點(diǎn)，提取時(shí)間短、溶劑使用少；使得樣品的揮發(fā)蒸汽和溶劑反復(fù)混合，達(dá)到充分提取的效果[7-8]。 同時(shí)蒸餾萃取雖然早在1946年就被發(fā)明使用，但并沒(méi)有廣泛的應(yīng)用到揮發(fā)油的萃取中來(lái)。 因此充分的利用這種方法，將其應(yīng)用到艾葉揮發(fā)油的提取上來(lái)，必將會(huì)促進(jìn)艾葉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

作者采用二氯甲烷和正己烷2 種溶劑，通過(guò)同時(shí)蒸餾萃取獲得艾葉揮發(fā)油，進(jìn)而研究揮發(fā)性油對(duì)常見(jiàn)微生物的抑菌活性，并對(duì)揮發(fā)油采用氣相色譜結(jié)合質(zhì)譜（GC-MS）的方法進(jìn)行成分分析，以及通過(guò)掃描電鏡（SEM）來(lái)觀測(cè)微生物細(xì)胞形態(tài)的變化，比較不同工藝的差異。 對(duì)比傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾的方法，從而挑選出艾葉揮發(fā)油的較優(yōu)提取工藝，深入研究艾葉揮發(fā)油的提取工藝和揮發(fā)性油的抗菌活性，為艾葉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

艾葉，購(gòu)于湖北省蘄春；二氯甲烷和正己烷為分析純，培養(yǎng)基及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)耗材均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 6890N-5973i 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（色譜柱：DB - WAX 毛細(xì)管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）、Agilent 7890N - 5875i （色譜柱：HP - 5毛細(xì)管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）， 美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；同時(shí)蒸餾萃取裝置，上海高信化玻儀器有限公司產(chǎn)品。

革蘭氏陽(yáng)性菌： 金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌CMCC B63501、單增李斯特菌ATCC 19115；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌ATCC 12900、變形桿菌CMCC B49027、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC 13076；真菌：黑曲霉ATCC 6633、釀酒酵母ATCC 9763，以上菌種均由上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院提供，并于-80 ℃存放。

1.2 艾葉揮發(fā)油提取

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取 依據(jù)權(quán)美平的研究[9]，稱(chēng)取100 g 艾葉原料，放入2000 mL 圓底燒瓶中，加入1500 mL 去離子水，加熱煮沸，3 h 后，收集提取物，計(jì)算提取率。 低溫密封保存，留用。

其中m 表示質(zhì)量。

1.2.2 同時(shí)蒸餾萃取 同時(shí)蒸餾萃取使用圖1 所示裝置，組裝好同時(shí)蒸餾萃取裝置，參照夏雪娟[10]的方法，稱(chēng)取100 g 艾葉原料，放入2000 mL 圓底燒瓶中，加入1500 mL 的去離子水；量取25 mL 二氯甲烷加入100 mL 圓底燒瓶中；開(kāi)始加熱。 萃取3 h后，收集提取物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，計(jì)算提取率，低溫密封保存，留用。

將二氯甲烷換為正己烷，重復(fù)上述操作。 萃取3 h 后，收集提取物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，計(jì)算提取率，低溫密封保存，留用。

1.3 抑菌活性

揮發(fā)油的成分決定其抑菌活性，而不同提取工藝會(huì)對(duì)揮發(fā)油成分產(chǎn)生很大的影響，因此對(duì)以上獲得的3 種揮發(fā)油進(jìn)行目標(biāo)菌種的抑菌活性研究，分析提取工藝對(duì)抑菌活性的影響。

1.3.1 抑菌圈試驗(yàn) 吸取100 μL 活化后的金黃色葡萄球菌菌液均勻涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基等分成4 個(gè)區(qū)域，在各個(gè)區(qū)域中間放置準(zhǔn)備好的直徑6 mm 的濾紙片， 移液槍吸取10 μL 水蒸氣蒸餾提取物滴至濾紙片中間，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋，用密封膜密封，放置培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，2種溶劑體系下的同時(shí)蒸餾萃取物重復(fù)以上步驟，觀察結(jié)果。 其它菌種選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，重復(fù)以上步驟，獲得抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]。

圖1 同時(shí)蒸餾萃取裝置Fig. 1 Schematic diagram of the simultaneous distillation and extraction experimental apparatus.

1.3.2 最低抑菌濃度 將3 種揮發(fā)油提取物用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇由50 μL/mL 起，二倍稀釋10 個(gè)濃度梯度，至0.05 μL/mL；吸取100 μL 活化后金黃色葡萄球菌菌液以及等量的相應(yīng)梯度濃度的提取物，混合均勻后，均勻涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋，用密封膜密封，放置培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。其它菌種選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，重復(fù)以上步驟，獲得抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12]。

1.4 GC-MS 成分分析

色譜柱型號(hào)：HP-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫程序： 起始溫度50 ℃保持1 min， 以4 ℃/min速度升溫至200 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min 的速度升溫至280 ℃保持至完成分析； 進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為He，流速為1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比為40∶1；70 eV 電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲5 min，質(zhì)量范圍10～550 amu。

1.5 掃描電鏡SEM 微生物形態(tài)變化觀察

收集以上最低抑菌濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)后的樣品，在3000 r/min 的條件下離心15 min，收集沉淀，加入pH 7.4 的PBS 洗滌2 次后，再次離心，再加入體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛（pH7.4 的PBS 稀釋?zhuān)? ℃下固定過(guò)夜（16 h），再次使用pH 7.4 的PBS 沖洗，使用乙醇梯度脫水，冷凍干燥，噴重金屬進(jìn)行SEM 觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)[13-14]。

2結(jié)果與討論

2.13 種工藝提取艾葉揮發(fā)油結(jié)果分析

按照選擇的提取方法以及設(shè)置的提取條件，獲得的提取物通過(guò)脫水后測(cè)定得率。 結(jié)果如表1 顯示，3 種提取工藝均可獲得艾葉揮發(fā)油，但傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾工藝需要提取4 h 才能最大限度的將揮發(fā)油提取完全，相較于同時(shí)蒸餾萃取工藝來(lái)說(shuō)，多用了1 h；而在得率上，同時(shí)蒸餾萃?。ǘ燃淄椋┑寐蕿?.5%，同時(shí)蒸餾萃?。ㄕ和椋┑寐蕿?.2%，2 種工藝的提取率相似， 且均高于水蒸氣蒸餾的0.5%；在顏色上，水蒸氣蒸餾萃取得物顏色更深，這可能因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫提取，使得揮發(fā)油得物的成分發(fā)生改變，分解或合成一些深色的成分；而同時(shí)蒸餾萃取工藝的提取時(shí)間較短，因而這種化學(xué)成分的變化幾率較低，比水蒸氣蒸餾萃取得物的顏色淺[15]。由以上結(jié)果，同時(shí)蒸餾萃取工藝相對(duì)于傳統(tǒng)的艾葉揮發(fā)油提取方法水蒸氣蒸餾萃取在提取時(shí)間和提取率上更具有優(yōu)勢(shì)。

表13 種工藝提取艾葉揮發(fā)油的提取結(jié)果Table 1 Yield of Artemisia argyi essential oils obtained by three different extraction methods

2.2 艾葉揮發(fā)油的抑菌活性結(jié)果分析

不同的提取工藝不僅對(duì)艾葉揮發(fā)油的提取率以及顏色和氣味等產(chǎn)生影響，對(duì)其生物活性有很大的影響。 抑菌活性是艾葉揮發(fā)油的一種重要的生物活性，因此這里對(duì)3 種工藝提取的艾葉揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行了研究。 包括抑菌圈和最低抑菌濃度試驗(yàn)，結(jié)果分別如圖2 和圖3 所示。

由圖2 可知，3 種工藝提取的艾葉揮發(fā)油都具有廣譜的抑菌活性，水蒸氣蒸餾萃取得物的抑菌圈結(jié)果是0.935～1.823 cm，但對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、變形桿菌、沙門(mén)氏菌）以及單增李斯特菌和真菌的結(jié)果主要集中在1 cm；SDE（正己烷）得物的范圍在1.123～1.580 cm， 且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的結(jié)果主要集中在1.5 cm；SDE（二氯甲烷）得物的范圍在0.728～1.528 cm， 但對(duì)多數(shù)受試菌的抑菌圈結(jié)果均在1 cm 以下。最低抑菌濃度（MIC）的結(jié)果又印證了抑菌圈結(jié)果，水蒸氣蒸餾萃取得物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌以及真菌的MIC 結(jié)果均為6.25 μL/mL，但對(duì)變形桿菌的MIC 達(dá)到25 μL/mL；SDE（正己烷）對(duì)革蘭氏陰性菌及真菌的MIC 結(jié)果均為6.25 μL/mL，對(duì)其它菌種的MIC 結(jié)果最高為12.5 μL/mL；SDE （二氯甲烷）對(duì)所有受試菌種的MIC 結(jié)果均大于12.5 μL/mL，甚至對(duì)沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、黑曲霉的MIC 結(jié)果達(dá)到了25 μL/mL。

圖23 種工藝提取艾葉揮發(fā)油的抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果 （抑菌圈直徑）Fig. 2 Inhibition zone of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

圖33 種工藝提取艾葉揮發(fā)油的最低抑菌濃度（MIC）Fig. 3 Minimum inhibitory concentration （MIC） of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

綜合以上抑菌圈和最低抑菌濃度的結(jié)果，從受試菌來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)中的革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌）相對(duì)于革蘭氏陰性菌和真菌對(duì)艾葉揮發(fā)油更敏感， 其抑菌圈更大，最低抑菌濃度更小；從提取工藝來(lái)說(shuō)，SDE（正己烷）得到的揮發(fā)油的抑菌活性比其余2 種工藝更具有廣譜抑菌性，且抑菌圈更大，最低抑菌濃度更低，更具有優(yōu)勢(shì)。 而SDE（二氯甲烷）的揮發(fā)油得物的抑菌活性低于另外2 種工藝的揮發(fā)油得物。

由此可見(jiàn)，不同提取方法獲得的艾葉揮發(fā)油的抑菌活性存在很大的差異，甚至同一種方法，不同溶劑下，其抑菌活性的差異也很大。 但得到這樣的結(jié)果，可能是因?yàn)橛捎谳腿r(shí)間長(zhǎng)，水蒸氣蒸餾萃取獲得的揮發(fā)油的成分比SDE 的種類(lèi)多，抑菌活性受多種成分協(xié)同的作用可能性大，因此水蒸氣蒸餾萃取得物對(duì)受試菌也有一定的抑制活性。 SDE 使用了有機(jī)溶劑，可能將揮發(fā)油中有抑菌活性的主要成分聚集，因此SDE（正己烷）的抑菌活性超過(guò)了水蒸氣蒸餾萃取的得物；但不同溶劑存在極性等性質(zhì)的差異，造成得到的艾葉揮發(fā)油的成分種類(lèi)，或者含量不同[16]，因此SDE（二氯甲烷）得物的抑菌活性比其余兩者較弱。

2.3 GC-MS 成分分析結(jié)果

不同的提取工藝會(huì)對(duì)揮發(fā)油的成分產(chǎn)生影響，因此本研究進(jìn)一步對(duì)3 種工藝提取獲得的艾葉揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS 成分分析，結(jié)果如表2 所示。 水蒸氣蒸餾萃取得物有66 種成分，SDE（二氯甲烷）得物有37 種成分，SDE（正己烷）得物有10 種成分；其中α-側(cè)柏酮、右旋樟腦、β-石竹烯、龍腦、氧化石竹烯、甲乙烯基萘酚等是3 種工藝得物的公共主要成分，這6 種成分分別占水蒸氣蒸餾得物、SDE （二氯甲烷）、SDE （正己烷） 總成分的44.23%、52.42%、92.95%。 由此可見(jiàn)，不同提取方法之間在得物的成分種類(lèi)數(shù)量上存在很大差異，不同溶劑下同時(shí)蒸餾萃取得物的成分種類(lèi)也有很大差異。 造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)樘崛r(shí)間的長(zhǎng)短造成得物成分的差異，而溶劑的極性等性質(zhì)的差異也是得物成分差異的主要原因[17-18]。

綜合以上結(jié)果，不同工藝的艾葉揮發(fā)油得物在成分的種類(lèi)和含量上確實(shí)有很大差異，因此這種結(jié)果亦能解釋抑菌活性的差異。 SDE（正己烷）的得物成分種類(lèi)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其余2 種工藝的得物，但其3 種工藝的得物的公共成分含量最高， 這些成分可能是艾葉揮發(fā)油抑菌活性的有效成分， 因此SDE（正己烷）的抑菌效果優(yōu)于其余2 種工藝的得物。

表23 種工藝提取艾葉揮發(fā)油的GC-MS 分析結(jié)果Table 2 Chemical composition (in percent) of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

續(xù)表2

2.4 掃描電鏡結(jié)果分析

通過(guò)抑菌活性的結(jié)果可知革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)艾葉揮發(fā)油更具有敏感性，而金黃色葡萄球菌的敏感程度尤為突出，為進(jìn)一步驗(yàn)證3 種工藝得物的抑菌活性的差異， 以及深入探索艾葉揮發(fā)油的抑菌機(jī)制，本研究進(jìn)而以處理后的金黃色葡萄球菌為目標(biāo)菌種， 采用掃描電鏡的方法觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，其結(jié)果如圖4 所示。

圖43 種工藝提取艾葉揮發(fā)油的SEM 分析結(jié)果Fig. 4 SEM results of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

從圖中可以看出細(xì)胞排列緊密，呈現(xiàn)出典型的葡萄球狀，而經(jīng)過(guò)3 種工藝提取得到的艾葉揮發(fā)油處理金黃色葡萄球菌后的細(xì)胞形態(tài) （圖4 中（a）、（b）、（c））與未使用艾葉揮發(fā)油處理的金黃色葡萄球菌的細(xì)胞形態(tài)（圖4 中（d））存在明顯差異。 （d）中因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和后期的處理，出現(xiàn)了微弱的細(xì)胞破碎[19-20]，如（d）中圓圈所示；（a）、（b）、（c）中均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞破碎，且程度都強(qiáng)于未由艾葉揮發(fā)油處理的（d）；（a）、（b）、（c）中的細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)一步證明艾葉揮發(fā)油具有明顯的抑菌活性，而細(xì)胞的破碎和變形，說(shuō)明艾葉揮發(fā)油的抑菌活性可能是因?yàn)閷?duì)微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞完成的。

3結(jié) 語(yǔ)

作者將同時(shí)蒸餾萃取作為艾葉揮發(fā)油的提取方法，使用同時(shí)蒸餾萃取常用的二氯甲烷作為提取溶劑， 引用未曾廣泛使用的正己烷作為第2 種溶劑， 對(duì)比傳統(tǒng)的艾葉揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾萃取法，系統(tǒng)的分析了提取率和工藝用時(shí)， 得知SDE 用時(shí)少，提取率高；通過(guò)抑菌活性的研究，得知SDE（正己烷）的抑菌活性強(qiáng)于其它2 種工藝；而對(duì)得物成分的GC-MS 分析結(jié)果可知SDE（正己烷）雖然成分種類(lèi)最少，但主要的成分含量很多，因此正己烷有望成為同時(shí)蒸餾萃取方法的重要溶劑；掃描電鏡的分析結(jié)果進(jìn)一步揭示艾葉揮發(fā)油的顯著抑菌效果，并表明艾葉揮發(fā)油會(huì)作用于微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑菌效果。 但深入的抑菌機(jī)理，主要的抑菌活性成分還尚待在以后的研究中繼續(xù)探索。