劉海燕， 張榮珍， 李利宏， 周麗仙， 徐 巖

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

蛋白酶（Protease）是一類能夠催化蛋白水解為小分子的多肽和氨基酸的水解酶類，其在動(dòng)植物及微生物中廣泛存在[1-2]。 根據(jù)不同分類標(biāo)準(zhǔn)，蛋白酶有多種分類， 其中根據(jù)其最適作用pH 的不同可將其分為堿性蛋白酶、 中性蛋白質(zhì)酶和酸性蛋白質(zhì)酶。 酸性蛋白酶是能在酸性環(huán)境下水解蛋白的蛋白酶類，其最適作用pH 在2.0～5.0 之間。 目前酸性蛋白酶已廣泛應(yīng)用于食品[3]、釀造[4]、皮革與皮毛[5]、醫(yī)藥[6]、飲料[7]等各個(gè)領(lǐng)域。 Sun 等[8]將來源于RhizomucormieheiCAU432 的一種酸性蛋白酶（RmproA） 作為嫩肉劑應(yīng)用于豬肉， 結(jié)果顯示經(jīng)過RmproA 處理后的豬肉比木瓜蛋白酶處理后的豬肉顯示更低的剪切力。 Steven 等[9]發(fā)現(xiàn)來自Botrytis cinerea的酸性蛋白酶BcAP8 能夠有效除去白酒釀造過程中產(chǎn)生的蛋白渾濁。 Swarna 等[10]將酸性蛋白酶應(yīng)用于皮革染色工藝并進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與對(duì)照相比，經(jīng)過酸性蛋白酶處理后的皮革表現(xiàn)出更加豐富的顏色和色調(diào)。 目前，國外對(duì)蛋白酶的研究主要集中在新品種的發(fā)掘、理想產(chǎn)生菌的選育以及酶學(xué)性質(zhì)的改造等。 而我國目前在這方面的研究尚存在許多不足，如微生物資源開發(fā)不足、酶制劑品種較為單一等[11]。 因此進(jìn)一步探索開發(fā)和研究新型酸性蛋白酶顯得很有必要。

研究表明，許多酶在細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)首先會(huì)以酶原形式出現(xiàn)，酶原主要包括3 部分：信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽[12]，其中前導(dǎo)肽對(duì)酸性蛋白酶的表達(dá)及正確折疊有著重要的作用。 前導(dǎo)肽能夠作為分子內(nèi)伴侶[13]或幫助蛋白質(zhì)正確折疊[14-15]；與此同時(shí)，研究證明前導(dǎo)肽對(duì)蛋白質(zhì)的功能活性也具有調(diào)節(jié)作用[12]。Wang 等[16]克隆了來源于Rhizomumor miehei的脂肪酶并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)如果不添加前導(dǎo)肽，目的蛋白則無法正常表達(dá)。Cai 等[17]發(fā)現(xiàn)若將來源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶的前導(dǎo)肽去除后于Pichia pastoris中異源表達(dá)， 其酶活低于帶有前導(dǎo)肽的重組脂肪酶。 目前關(guān)于酸性蛋白酶的前導(dǎo)肽對(duì)酶蛋白在大腸桿菌中表達(dá)和功能影響的研究很少。

本研究對(duì)來源于Aspergillus pseudoglaucus的酸性蛋白酶App 進(jìn)行了重組表達(dá)，考察了包含其自身前導(dǎo)肽在內(nèi)的共5 種前導(dǎo)肽對(duì)酶蛋白的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的影響。 研究了重組酶的最適酶活條件，分析了不同前導(dǎo)肽對(duì)App 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，測(cè)定了App 對(duì)乳蛋白的水解酶活，為App 的進(jìn)一步研究及工業(yè)應(yīng)用提供了良好的研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 本研究中使用的菌株和質(zhì)粒如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this work

續(xù)表1

表2 實(shí)驗(yàn)引物Table 2 Primers in this work

續(xù)表2

1.1.3 基因 4 種酸性蛋白酶的基因分別是： 來自Candida tropicalis的candidapepsin 基 因， 來 自Saccharomyces cerevisiaeS288c 的proteinase A 基因， 來自Rhizomucor miehei的proteinase 的基因和來自Candida albicans的aspartic proteinase 2 的基因，所有基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4 主要試劑 PrimeSTAR HS（Premix）、T4 DNA Ligase、DNA Marker、 限制性內(nèi)切酶、IPTG， 購于TaKaRa 生物有限公司；質(zhì)粒提取、凝膠回收和DNA回收試劑盒，購于OMEGA BIO-TEK。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。 其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 馬鈴薯培養(yǎng)基 （g/L）： 馬鈴薯200，葡萄糖20；pH 7.0；添加1.5 g/dL 瓊脂粉即為馬鈴薯固體培養(yǎng)基。 將A. pseudoglaucus菌種分別接種于裝有5 mL 馬鈴薯液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 基因組DNA 將菌體于10000 r/min 離心2 min 并收集細(xì)胞， 用1 mL 超純水離心洗滌2 次（10000 r/min，2 min）。 依次加入0.2 mL 無菌水、0.3 g 玻璃珠（0.4 mm）和0.3 mL 的PC（苯酚∶氯仿體積比為1∶1 的混合物）混勻，使用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞30 s 后加入0.6 mL 超純水，顛倒混勻。 10000 r/min離心10 min。 取上清液300～400 μL 加入2 倍體積冰乙醇，4 ℃靜置4 h 后10000 r/min 離心15 min。棄上清液，真空干燥至無乙醇，加入50 μL 無菌水溶解基因組。

1.2.3ProApp和App基因的獲得 以A. pseudoglaucus基因組為模板，通過DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)引物如表2中所示 （下劃線為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)）。 以A. pseudoglaucus基因組為模板，PCR 擴(kuò)增App基因，條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68.5 ℃30 s，72 ℃60 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。 以A. pseudoglaucus基因組為模板，PCR 擴(kuò)增proApp基因， 條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68.5 ℃30 s，72 ℃69 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，進(jìn)行加A 處理后連接至pMD19-T 上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素），獲得陽性克隆后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和XhoI 分別對(duì)質(zhì)粒T-App和質(zhì)粒T-proApp進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 不同前導(dǎo)肽App 基因的獲得 利用重疊延伸PCR 法，第1 步：以合成的4 種酸性蛋白酶基因?yàn)槟０澹?分別以表2 中相對(duì)應(yīng)每組中f1和r1為引物，PCR 擴(kuò)增前導(dǎo)肽基因，分別是來自C.tropicalis的candidapepsin 的前導(dǎo)肽基因CP， 來自S. cerevisiaeS288c 的proteinase A 的前導(dǎo)肽基因PP， 來自R.miehei的proteinase 的前導(dǎo)肽基因RP和來自C.albicans的aspartic proteinase 2 的前導(dǎo)肽基因SP，條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s，Tm30 s，72 ℃10 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。 其中變性溫度Tm按CP、PP、RP、SP的順序依次為55、55、55.8、52.8 ℃。 以proApp基因?yàn)槟０澹謩e以表2 中相對(duì)應(yīng)每組中f2和R2為引物，PCR 擴(kuò)增App基因，條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68 ℃30 s，72 ℃60 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR 產(chǎn)物。第2 步：將第一步回收獲得的前導(dǎo)肽基因和與之對(duì)應(yīng)的App基因互為模板和引物，補(bǔ)齊其他擴(kuò)增反應(yīng)試劑，獲得帶有不同來源的前導(dǎo)肽App基因的PCR 產(chǎn)物 （CP-App、PP-App、RP-App、SP-App）， 條件為98 ℃30 s；98 ℃10 s，66.9 ℃30 s，72 ℃60 s，10 次循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 結(jié)束后分別在管中加入每組相對(duì)應(yīng)的引物F1和R2，繼續(xù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，條件為98 ℃30 s；98 ℃10 s，66.9 ℃30 s，72 ℃70 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)柱純化后， 進(jìn)行加A 處理后連接至pMD19-T 上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），獲得陽性克隆后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI 分別對(duì)質(zhì)粒T-CP-App、 質(zhì)粒T-PP-App、質(zhì)粒T-RP-App和質(zhì)粒T-SP-App進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI 分別對(duì)載體pET-28a、 質(zhì)粒T-App、 質(zhì)粒T-proApp進(jìn)行雙酶切； 使用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI 分別對(duì)載體pET-28a、 質(zhì)粒T-CP-App、質(zhì)粒T-PP-App、 質(zhì)粒T-RP-App和質(zhì)粒T-SP-App進(jìn)行雙酶切。 所有酶切產(chǎn)物回收DNA 片段通過粘性末端連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-App、pETproApp、pET-CP-App、pET-PP-App、pET-RP-App和pET-SP-App。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素），獲得陽性克隆后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 重組菌株的構(gòu)建 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coliBL21 （DE3）菌株，從卡那霉素抗性平板上篩選出重組菌株E. coliBL21/pETApp、E. coliBL21/pET-proApp、E. coliBL21/pETCP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SP-App的 陽 性克隆。

回顧性選取2017年4月-2018年4月在我院行血液透析治療64例患者的臨床資料,其中男34例,女30例,年齡16-80歲,平均年齡(53.7±6.8)歲,平均透析病程(3.1±1.7)年,按疾病分類:急性腎衰竭患者26例,慢性腎衰竭38例。

1.2.7 蛋白純化 從平板上挑取重組菌E. coliBL21/pET-App、E. coliBL21/pET-proApp、E. coliBL21/pET-CP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E.coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SPApp的單菌落分別接種于含有50 μg/mL 卡那霉素的200 mL LB 液體培養(yǎng)基中， 當(dāng)菌體培養(yǎng)的OD600值達(dá)到0.6～0.8 時(shí)， 加入終濃度為0.1 mmol/L 的誘導(dǎo)劑IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。 將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心，收集菌體，使用生理鹽水洗滌3 次后重懸于20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），超聲破碎。12000r/min，4 ℃離心收集上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后的濾液即為粗酶液。 利用鎳離子親和層析柱。

1.2.8 酶活力測(cè)定 蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸，酪氨酸在堿性條件下使福林酚試劑還原生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，在680 nm 處有最大吸光度，其吸光值與酪氨酸含量成正比。 因此可通過測(cè)定反應(yīng)過程中680 nm 處吸光度的變化來衡量蛋白酶的活力。酶活測(cè)定方法參照國標(biāo)GB/T 23527-2009， 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。蛋白質(zhì)含量采用Bradford 法測(cè)定[18]，以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。 定義1 個(gè)酶活單位（U）為每分鐘催化產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量。

1.2.9 乳蛋白水解活性測(cè)定 以乳蛋白為底物測(cè)定蛋白酶對(duì)其水解活力。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.2.10 圓二色譜分析 以10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）為溶劑將純化蛋白稀釋至0.1 mg/mL，使用Jasco J720 光譜儀在25 ℃條件下進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，光譜值范圍為190～250 nm，掃描速度50 nm/min，帶寬2 nm，反應(yīng)時(shí)間1 s，讀數(shù)30 次，取信號(hào)平均值并基線校正， 將所測(cè)定的CD 值轉(zhuǎn)換成摩爾橢圓度（molar ellipticity） θ （deg×cm2×dmol-1），用計(jì)算機(jī)專用 軟 件 （J-700 for Windows Secondary Structure Estimaton, Version 1.10.00） 分析各蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成[19]。

2結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pET-App 和pET-proApp 的構(gòu)建

以A.pseudoglaucus基因組為模板， 分別以App_F 和App_R、proApp_F 和proApp_R 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得目的基因App和proApp，經(jīng)過1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳分析其條帶大小約為為1.0 kb和1.1 kb。將App和proApp基因片段連入pMD19-T，經(jīng)EcoR I 和XhoI 雙酶切后連入pET-28a 載體。2 種重組質(zhì)粒均經(jīng)雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)入E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中， 挑取陽性克隆提取質(zhì)粒并送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示2 種基因均已克隆到相應(yīng)表達(dá)載體上，獲得重組質(zhì)粒pET-App和pET-proApp。測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliBL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞獲得重組表達(dá)菌株。

2.2 不同前導(dǎo)肽App 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別以proApp基因和合成的4 種酸性蛋白酶基因?yàn)槟０澹?進(jìn)行重疊延伸PCR， 獲得目的基因CP-App、PP-App、RP-App和SP-App，經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳其條帶大小為1.1 kb 左右。 將基因片斷連入pMD19-T，經(jīng)BamH I 和XhoI 雙酶切后連入pET-28a 載體。 4 種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定后送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示2 種基因均已克隆到相應(yīng)表達(dá)載體上， 獲得重組質(zhì)粒pET-CP-App、pET-PP-App、pET-RP-App和pET-SP-App。 測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliBL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞獲得重組表達(dá)菌株。

2.3 重組蛋白酶的表達(dá)及純化

挑取E. coliBL21/pET-App、E. coliBL21/pETproApp、E. coliBL21/pET-CP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SP-App的單菌落至含卡那霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 分別在20、25 ℃和30 ℃條件下，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后收集菌體，洗滌后重懸于Tris-HCl 緩沖液中，超聲破碎、離心、過膜得到粗酶液。取上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳，如圖1 所示。 結(jié)果顯示E. coliBL21/pET-App在3 種溫度下的破碎上清液和沉淀均未見目的蛋白質(zhì)條帶， 其他蛋白酶重組菌株均在20 ℃條件下實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，破碎上清液中存在目的蛋白條帶。 由此說明前導(dǎo)肽有助于App 蛋白酶在大腸桿菌中表達(dá)。然后將粗酶液使用Ni 柱進(jìn)行分離純化， 經(jīng)SDSPAGE 電泳分析， 重組蛋白純化后獲得目的蛋白條帶均一，約為5.5×104，與理論相對(duì)分子質(zhì)量大小一致（圖2）。 純化蛋白于-80 ℃保存，用于后續(xù)研究。

圖1 重組蛋白酶的表達(dá)Fig. 1 Expression of E. coli BL21/pET-App, E. coli BL21/pET-proApp, E. coli BL21/pET-CP-App, E. coli BL21/pET-PP-App, E. coli BL21/pET-RP-App and E.coli BL21/pET-SP-App

圖2 重組蛋白酶的純化Fig. 2 Purification of the recombinant proteases

2.4 重組蛋白酶酶活的測(cè)定

在pH 3.0 條件下，以酪蛋白為底物，在不同溫度下測(cè)定了重組酶的酶活。 結(jié)果顯示除了proApp具有較高的酶活外，其他重組蛋白酶均未檢測(cè)到酶活。 在55 ℃時(shí)proApp 的酶活力達(dá)到最高， 為826 U/mg（圖3（a））。在55 ℃條件下，不同pH 時(shí)，proApp的蛋白酶活進(jìn)行了測(cè)定，但由于酪蛋白的等電點(diǎn)在4.5 左右， 在pH 3.5～5.5 范圍內(nèi)酪蛋白不溶或溶解度很小，因此測(cè)定最適pH 時(shí)pH 的范圍在2.2～3.2。結(jié)果顯示除了proApp 具有酶活外， 其他重組蛋白酶均無酶活。當(dāng)pH 為2.8 時(shí)proApp 達(dá)到最大酶活，為903 U/mg（圖3（b））。上述結(jié)果表明不同來源的前導(dǎo)肽雖然能夠使App 在大腸桿菌中成功可溶性表達(dá)，但不能促使蛋白質(zhì)正確折疊， 導(dǎo)致蛋白酶沒有酶活。 為了探索不同前導(dǎo)肽對(duì)App 酶活影響的原因，后續(xù)試驗(yàn)對(duì)所有重組蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。

圖3 不同溫度下和不同pH 下proApp 的酶活Fig. 3 Protease activities of proApp at different temperature and different pH

2.5 重組蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

從圖4 可以看出， 隨著波長(zhǎng)的變化，CP-App、PP-App、RP-App、SP-App 與proApp 的摩爾橢圓度顯示出完全不同的變化趨勢(shì)， 說明proApp 的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其他4 種具有不同前導(dǎo)肽蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在很大差異，CP、PP、RP 和SP 這4 個(gè)前導(dǎo)肽改變了App 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其未能正確折疊。 二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果證實(shí)了4 種其他來源的前導(dǎo)肽雖然能夠使App 蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，但無法促使其正確折疊，因而表現(xiàn)為沒有酶活。

圖4 proApp、CP-App、PP-App、RP-App 和SP-App 的圓二色譜分析Fig. 4 Circular dichroism analysis of secondary structures for proApp、CP-App、PP-App、RP-App and SPApp

2.6 ProApp 乳蛋白水解活性的測(cè)定

以乳蛋白為底物， 檢測(cè)不同條件下proApp 對(duì)乳蛋白的水解活力，結(jié)果如圖5 所示。 在pH 3.0 條件下， 在不同溫度條件下對(duì)proApp 水解乳蛋白活性的活性進(jìn)行了檢測(cè)。 可以發(fā)現(xiàn)在55 ℃條件下，proApp 對(duì)乳蛋白的水解活性達(dá)到最大為160 U/mg。在55 ℃條件下，在不同pH 條件下，對(duì)proApp 水解乳蛋白的活性進(jìn)行了檢測(cè)。 可以發(fā)現(xiàn)在pH 2.2 時(shí)，proApp 對(duì)乳蛋白的水解活性達(dá)到最大值，為252 U/mg。以上結(jié)果表明proApp 對(duì)乳蛋白具有較好的水解活力。

3結(jié) 語

酸性蛋白酶是能夠在酸性環(huán)境下具有水解活性的蛋白酶類，近年來隨著人們對(duì)其研究越來越深入，其應(yīng)用也越來越廣泛[20]。近年來國外對(duì)蛋白酶的研究主要在新品種的發(fā)掘、理想蛋白酶產(chǎn)生菌的選育和酶的改造以適應(yīng)工業(yè)需求。 而我國目前在這方面的研究尚存在許多問題如微生物資源開發(fā)不足、酶制劑品種較為單一等。 因此進(jìn)一步探索開發(fā)和研究新型酸性蛋白酶顯得很有必要。 本研究從基因工程和蛋白質(zhì)工程角度出發(fā)，對(duì)來源于A. pseudoglaucus的酸性蛋白酶App 進(jìn)行了重組表達(dá)并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。 通常情況下，酸性蛋白酶在細(xì)胞中首先是以酶原形式出現(xiàn)的， 酶原主要包括3 部分：信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽。 其中前導(dǎo)肽對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和折疊有著重要意義[21-22]。 此外也有研究表明前導(dǎo)肽對(duì)蛋白質(zhì)的功能活性具有修飾和調(diào)節(jié)作用。我們分別構(gòu)建了2 種重組App 蛋白酶表達(dá)菌株即加前導(dǎo)肽的重組菌株E. coli BL21/pET-proApp 和不加前導(dǎo)肽的重組菌株E. coli BL21/pET-App。 通過誘導(dǎo)表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)若不加前導(dǎo)肽App 不能在大腸桿菌中表達(dá)。為了進(jìn)一步探索前導(dǎo)肽對(duì)App 的表達(dá)和酶功能的影響， 選取了4 個(gè)不同來源的前導(dǎo)肽，通過重疊延伸PCR 技術(shù)將前導(dǎo)肽基因加到App基因5′端， 構(gòu)建了4 株重組酸性蛋白酶表達(dá)菌株E.coli BL21/pET-CP-App、E.coli BL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App 和E. coliBL21/pET-SP-App。分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳分析，發(fā)現(xiàn)4 種重組蛋白酶均成功可溶性表達(dá)。 然而對(duì)5 種具有不同前導(dǎo)肽的App 蛋白酶的酶活檢測(cè)結(jié)果顯示， 除proApp具有酶活外， 最大酶活為903 U/mg，其他含有其他來源前導(dǎo)肽的4 種重組蛋白酶均無酶活。 對(duì)5 種含有前導(dǎo)肽的蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)CP-App、PP-App、RP-App和SP-App 的二級(jí)結(jié)構(gòu)與proApp 的二級(jí)結(jié)構(gòu)有很大差異，說明前導(dǎo)肽可以改變蛋白質(zhì)的折疊，從而影響蛋白質(zhì)的功能。 最后我們對(duì)proApp 的乳蛋白水解活性進(jìn)行了研究， 發(fā)現(xiàn)proApp 對(duì)乳蛋白在酸性條件下具有較好的水解能力，水解活性最大可達(dá)252 U/mg。 本研究探索了前導(dǎo)肽對(duì)App 重組酶的表達(dá)和酶活的影響，表明前導(dǎo)肽的種類對(duì)App 的表達(dá)和結(jié)構(gòu)具有決定性的影響，為進(jìn)一步探索App 對(duì)蛋白質(zhì)的水解工業(yè)應(yīng)用提供了較好的研究基礎(chǔ)。

圖5 不同溫度和不同pH 下proApp 對(duì)乳蛋白的水解活性Fig. 5 Hydrolytic activities of proApp towards milk protein at different temperature and different pH