ULIHO Alphonse， 楊套偉， 苑曼曼， 徐美娟， 張 顯，MUGISHA Samson， 周俊平， 饒志明*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫21412）

氨肽酶（EC 3.4.11）廣泛存在于原核生物和真核生物細(xì)胞中，該類酶主要生理功能是從N 末端切割肽或蛋白質(zhì)[1-4]。 微生物因具有多樣性、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，是氨肽酶最重要的來源之一。 據(jù)報(bào)道，鏈霉菌屬、曲霉屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬均能產(chǎn)生氨肽酶[5-9]。 與動(dòng)物和植物氨肽酶相比，微生物氨肽酶由于其催化效率高，穩(wěn)定性好和容易生產(chǎn)而在工業(yè)上廣受歡迎。 此外，氨肽酶具有廣泛的底物特異性，在分子測序，藥物和食品工業(yè)等多種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。 在食品工業(yè)中，氨肽酶主要用于水解蛋白質(zhì)水解物、蛋白質(zhì)和肽等。 此外，氨肽酶還被用于調(diào)味品的食品添加劑，用于提升調(diào)味品的營養(yǎng)價(jià)值和口味[6]。 近年來，已有研究報(bào)道通過定點(diǎn)改造提高氨基肽酶的熱穩(wěn)定性等。

枯草芽孢桿菌具有安全性、生產(chǎn)快、產(chǎn)酶廣等特征，廣泛應(yīng)用于酶的生產(chǎn)[8]。 最近，來自枯草芽孢桿菌Zj016 的氨肽酶（BASP）已被表征為金屬氨肽酶， 它與由枯草芽孢桿菌168 來源的氨肽酶編碼基因ywaD 序列相似性較高。 這2 種氨肽酶（YwaD 和BSAP）都屬于氨基肽酶28 家族。該家族中來源于鏈霉菌灰色氨肽酶 （SAG）， 鏈霉菌Th-2 氨肽酶（SSAP）和嗜熱氣單胞菌氨基肽酶（AAP）結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制模型已被解析[7,10]?；谕唇：徒Y(jié)構(gòu)分析表明， 氨肽酶BSAP 和YwaD 都具有長約150 個(gè)氨基酸的底物結(jié)構(gòu)域， 其含有2 個(gè)α-螺旋和7 個(gè)β-折疊。

在本研究中，旨在通過定向突變技術(shù)改變底物結(jié)合區(qū)域的氨基酸殘基的疏水性，考察其對氨肽酶熱穩(wěn)定性的影響。 基于氨基肽酶YwaD 同源建模和結(jié)構(gòu)分析， 發(fā)現(xiàn)在底物結(jié)合區(qū)存在一些親水殘基；隨后， 我們嘗試?yán)檬杷畾埢〈@些親水殘基，以增加該區(qū)域的疏水相互作用，為該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)提供更多的剛性，從而提高其熱穩(wěn)定性。 我們首先選取了6 個(gè)親水殘基位點(diǎn)，隨后發(fā)現(xiàn)，只有第385 天冬酰胺被疏水性殘基L385 取代時(shí)， 其與其鄰域氨基酸的疏水相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致該酶的熱穩(wěn)定性增加。

1材料與方法

1.1 試劑、菌株和質(zhì)粒

Bacillus subtilis 168、E. coli JM109、pMA5 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保藏； 限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、ExTag DNA 聚合酶，購自大連寶生物公司；用于定點(diǎn)突變的快速同源重組試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；底物氨基?；?硝基苯胺，購自上海麥克林生物化學(xué)公司（中國）；其他溶劑均為商業(yè)化產(chǎn)品。

1.2 重組菌株的構(gòu)建

以B. subtilis 168 來源的氨肽酶YwaD 的DNA序列為模板設(shè)計(jì)引物，同時(shí)設(shè)計(jì)了突變體所需引物序列（表1），引入了6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽（6×His 標(biāo)簽），便于后期分離純化。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物Table 1 Primers used in this work

以B. subtilis168 染色體DNA 為模板， 利用引物對ywaD-F/ywaD-R，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得ywaD基因。 將PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后，與表達(dá)載體質(zhì)粒pMA5 連接， 獲得重組質(zhì)粒pMA5-ywaD，按照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法，將經(jīng)過測序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pMA5-ywaD 轉(zhuǎn)化到B. subtilis168中，獲得重組菌株B. subtilis168/pMA5-ywaD。

利用引物對ywaD-F (N385L)/ywaD-R(N385L)，以pMA5-ywD 為模板，并使用高保真DNA 聚合酶,通過PCR 擴(kuò)增將所需的突變N385L 插入到y(tǒng)waD基因中獲得突變基因。 將純化后PCR 產(chǎn)物用exnaseII 酶在37 ℃處理30 min 后，用Dpn I 酶消化完全甲基化和未突變的親代DNA 1 h 以提高突變效率[12]。 將得到的質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步測序驗(yàn)證，以確保突變成功。 然后將突變正確的重組質(zhì)粒pMA5-N385L 轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌168 中，獲得重組菌株B. subtilis168/pMA5-N385L。

1.3 菌株培養(yǎng)及氨肽酶的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基：23.6 g/L 酵母提取物、11.6 g/L 胰蛋 白 胨、9.4 g/L K2HPO4、2.2 g/L KH2PO4、4 ml/L 甘油、0.6 mml/L Co2+和50 μg/mL 卡那霉素，調(diào)節(jié)pH至pH（7.2±0.2）。 重組菌株B.subtilis168/pMA5-ywaD 和B. subtilis168/pMA5-N385L 分別在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，然后4 ℃、10000 r/min 離心10 min 收集發(fā)酵液上清液，收集的上清液即為氨基肽酶粗酶液。

將體積分?jǐn)?shù)60%的無水乙醇加入到上述氨基肽酶粗酶液進(jìn)行酶液濃縮， 然后4 ℃，10000 r/min離心20 min 收集樣品沉淀。接著，將樣品沉淀重懸于50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）中進(jìn)行透析，每12 h 后更新一次緩沖液，透析48 h。隨后，將用4.5 μm濾膜過濾后的樣品加入到裝有DEAE-Sepharose Fast Flow 柱（GE Healthcare，USA）Ni2+-NTA（次氮基三乙酸酯）AKTA 純系統(tǒng)中，用陰離子交換柱進(jìn)行分離純化（流速0.5 mL/min， 結(jié)合緩沖液：0.02 mol/L Tris-HCl buffer, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4)。 粗酶液吸附至1 mL HisTrapTMHP 純化柱上后， 用劑量1 mL咪唑進(jìn)行梯度（0～500 mmol/L） 洗脫。 最后， 通過SDS-PAGE 分析純化后酶的純度[13]。 根據(jù)Bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定[14]。

1.4 酶活測定

根據(jù)文獻(xiàn)[15-19]報(bào)道的氨肽酶測定方法略微進(jìn)行了改進(jìn)， 用于檢測突變型N385L 和野生型氨肽酶YwaD 酶活。1.5 mL 反應(yīng)體系：50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5），適量的純化酶，4 mmol/L 的L-亮氨酸-對硝基苯胺（L-Leu-pNA）底物，40 ℃反應(yīng)10 min，隨后加入1.5 mL 無水乙醇終止反應(yīng)。 在405 nm 處測量吸光值。 氨基肽酶酶活定義：1 min 釋放1 μmol/L 對硝基苯胺所需的酶量為一個(gè)單位（U）。 用Bradford 法測定樣品中蛋白質(zhì)含量[14]。 所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5 氨肽酶酶學(xué)特性表征

1.5.1 溫度和pH 對酶活性和穩(wěn)定性的影響 將純化后的野生型和突變體氨肽酶分別置于20～80 ℃環(huán)境中，考察其最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性。在pH 6.0～11.0范圍內(nèi)考察其最適pH，使用50 mmol/L 的不同緩沖液：磷酸鹽緩沖液（pH 6.5～7.5），Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0～9.0），碳酸鹽緩沖液（pH 9.5～11.0）。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5.2 金屬離子氨肽酶活性的影響 在含有0.1 mmol/L 或 1 mmol/L Ca2+（CaCl2），Mg2+（MgSO4·7H2O），Mn2+（MnCl2·4H2O），Cu2+（CuCl2·2H2O），Ni2+（NiCl2·6H2O），Co2+（CoCl2·6H2O），Zn2+（ZnCl2） 的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5）中測定二價(jià)金屬離子對氨肽酶的影響。為了檢測抑制劑/螯合劑對氨肽酶的影響， 使用了以下抑制劑：PMSF、 卡巴明、EDTA、SDS 和Bestatin。 對照組采用純酶與50 mmol/L（pH 8.5） 的Tris-HCl 緩沖液混合而不添加任何離子或抑制劑。 所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定 在不同底物濃度（0.5～5mmol/L）下測定動(dòng)力學(xué)參數(shù)， 例如Km、Kcat和Kcat/Km。 使用Lineweaver-Burk 曲線來估計(jì)Km和Vmax， 該曲線符合Michaelis-Menten 方程[17，20]。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.6 結(jié)構(gòu)分析

將ywaD 基因序列（Gene bank：AGA22702.1.1）提交到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型數(shù)據(jù)庫（https://www.swissmodel.expasy.org） 所生產(chǎn)的PDB （蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫） 結(jié)構(gòu)作為比較模型。 相關(guān)結(jié)果采用軟件Studio software 2.5 進(jìn)行分析。

2結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析的比較同源性

根據(jù)網(wǎng)站https://www.swissmodel.expasy.org 生成的B. subtilis168 來源的氨肽酶PDB 3D 結(jié)構(gòu)和軟件Studio software 2.5 分析，我們初步選擇了底物結(jié) 合 區(qū) 的6 個(gè) 氨 基 酸 殘 基（ASN338、ASN385、GLY389、PHE386、PHR366 和THR393）作為突變對象，根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)N385 殘基突變?yōu)槭杷詺埢鵏385 時(shí)，氨肽酶酶活和熱穩(wěn)定性較好。

圖1 SDS-PAGE 分析氨肽酶及突變體N385LFig. 1 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type YwaD and its mutant N385L

根據(jù)SDS-PAGE 分析，野生型氨肽酶和突變體N385L 分別成功在枯草芽孢中過量表達(dá)， 氨肽酶相對分子質(zhì)量大小為49450 （圖1）。 重組菌株B.subtilis168/pMA5-ywaD 與B. subtilis168/pMA5-N385L 發(fā)酵液中氨肽酶酶活基本一致，為50.96 U/mL左右。 這與枯草芽孢桿菌Zj016 來源的氨肽酶在B. subtilis168 過表達(dá)的酶活力（（52±1.9） U/mL）基本一致，可能原因是采用了相同的信號肽[21]。而野生型YwaD 和突變體N385L 的比活力分別為134.3 U/mg 和129.6 U/mg，即N385 位點(diǎn)突變對其比活力略有影響。

2.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

參照材料和方法部分所述方法測定Kcat、Km和催化效率（Kcat/Km）。 如表2 所示，與野生型相比，突變型N385L 對底物的親和力提高了47.4%，催化效率提高了28.5%。其主要原因可能是，突變體底物結(jié)合區(qū)域中的疏水相互作用的提高使酶和底物結(jié)合更緊密。

表2 氨基肽酶及其突變體N385L 動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of the purified wild-type YwaD and its mutant N385L

2.3 氨肽酶酶學(xué)特性表征

2.3.1 溫度對重組氨肽酶的影響 由圖2（a）可知，N385L 位點(diǎn)的突變對氨肽酶的最適催化溫度沒有影響，突變前后最適溫度均為40 ℃，這與枯草芽孢桿菌Zj016 來源的氨肽酶最適溫度（55 ℃）不同[10，21]。較低的最適反應(yīng)溫度在工業(yè)生產(chǎn)過程中更具有優(yōu)勢，因?yàn)槠湫枰俚臒崃俊?/p>

由圖2（b）可知，N385L 位點(diǎn)的突變能夠提高氨肽酶的熱穩(wěn)定性， 在80 ℃放置30 min 時(shí)， 野生型YwaD 完全失活，而突變體N385L 仍保留20%的酶活力。另外，在最適催化溫度（40 ℃）下溫育36 h，突變體N385L 能夠保持80%以上活力， 而野生型YwaD 在相同條件下僅保留60%的活力。 這種熱穩(wěn)定性的增加， 是由底物結(jié)合區(qū)域中的L385 取代親水性殘基N385 引起的。 該疏水性殘基L385 代替N385 直接與底物接觸，增加了底物與氨肽酶YwaD的疏水相互作用。 顯然，增強(qiáng)的疏水性相互作用更穩(wěn)定了過渡態(tài)，使酶具有更好的穩(wěn)定性。 另外，疏水性相互作用的存在縮短了底物與酶之間的距離，并使它們接觸更緊密，提高了酶的穩(wěn)定性。Gao 等通過序列分析發(fā)現(xiàn)在氨肽酶非催化區(qū)域含有一段熱敏域，通過刪除該熱敏域片段，氨肽酶在30min 內(nèi)半衰期從71 ℃提高至77 ℃[1]。

2.3.2 pH 對重組氨肽酶的影響 如圖3（a）所示，突變體N385L 在堿性pH（pH 8～9）范圍中顯示出良好的活性，最適pH 為8.5，這與之前報(bào)道的其他氨肽酶相一致[16，22-25]。隨后考察了酶的pH 穩(wěn)定性（圖3（b）），當(dāng)?shù)陀谧钸mpH 8.5 時(shí)，突變體N385L 的活力隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加（12 h 內(nèi)），但高于最適pH 8.5時(shí)，突變體N385L 的活力隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而輕微降低。 顯然，突變型氨肽酶N385L 可以長時(shí)間在最佳pH 下工作。

圖2 溫度對突變體N385L 活性和穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Temperature effect on the activity and stability of mutant N385L

圖3 pH 對突變體N385L 活性和穩(wěn)定性的影響Fig. 3 pH effect on the activity and stability of mutant N385L

2.3.3 金屬離子對重組氨肽酶的影響 添加0.1 mmol/L 金屬離子時(shí)， 野生型酶和突變體N385L 被Co2+離子激活， 且突變體N385L 被高度激活（192.2%），證實(shí)該氨肽酶是金屬氨肽酶。 金屬離子對野生型和突變體N385L 表現(xiàn)了抑制作用均為：Mn2+＜Mg2+＜Cu2+＜Ca2+＜Ni2+＜Zn2+， 高濃度的金屬離子對氨肽酶抑制性加強(qiáng)（表3）。 這些現(xiàn)象與之前的研究報(bào)道一致，不穩(wěn)定的鋅離子可被鈷離子取代可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性[19，26]。

表3 離子對重組氨肽酶N385L 突變體的影響Table 3 Effect of metal ions on the activity of mutant N385L

3結(jié) 語

氨肽酶因具有廣泛的底物譜使其在藥物和食品工業(yè)等多種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[27]，本研究中基于氨肽酶底物結(jié)合區(qū)域氨基酸特性分析，將枯草芽孢桿菌來源氨肽酶第385 位親水性氨基酸殘基N 突變?yōu)槭杷被釟埢鵏， 突變體N385L 穩(wěn)定性、對底物氨基酰基-硝基苯胺的親和力和催化效率得到明顯提高。 因此，本研究中獲得的具有良好工業(yè)屬性的氨基肽酶將具有更好的工業(yè)應(yīng)用前景。