蔡昌呈 雷超 何豹 魏麗麗 趙冬

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神經(jīng)外科臨床最常見的危急重癥之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，自發(fā)性SAH占所有腦血管疾病的1%～7%，具有非常高的致死率和致殘率[1]。盡管目前針對(duì)SAH的發(fā)病機(jī)制與研究有所突破，但SAH后的致死率、致殘率卻未得到明顯改善。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)的治療一直以來是改善SAH預(yù)后的重要方法，但既往針對(duì)CVS的治療往往不能取得臨床滿意效果[2]。近年來，眾多學(xué)者將研究方向轉(zhuǎn)向了顱內(nèi)微血管痙攣。研究證實(shí)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂后會(huì)出現(xiàn)腦大血管痙攣[3]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAH后軟膜微動(dòng)脈出現(xiàn)了病理性收縮和功能障礙，腦實(shí)質(zhì)微動(dòng)脈和穿支微動(dòng)脈亦出現(xiàn)收縮并導(dǎo)致皮層血流減少[4]?？p隙連接蛋白在血管收縮中發(fā)揮重要作用，其基本組成單位為連接蛋白(Connexin，Cx)。血管壁上存在Cx37、Cx40、Cx43和Cx45 4種縫隙連接蛋白。當(dāng)血管壁中縫隙連接蛋白水平發(fā)生變化時(shí)，可導(dǎo)致血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[5]。該研究通過觀察SAH后軟腦膜微動(dòng)脈和基底動(dòng)脈縫隙連接蛋白的變化，以及縫隙連接蛋白在大動(dòng)脈和微動(dòng)脈痙攣中的作用差異，從而了解縫隙連接蛋白與血管痙攣之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取成年、雄性、健康SD大鼠90只，體重(300±50)g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心〔許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0001〕。大鼠飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度18～25℃，濕度為40%，光照、黑暗各12 h。將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組(21只)、假手術(shù)組(20只)、SAH模型組(26只)和18β-甘草次酸(18β-GA)干預(yù)組(23只，以下簡稱干預(yù)組)。實(shí)驗(yàn)操作符合美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷和使用指南》(1996年修訂版)，同時(shí)該研究通過石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑及設(shè)備主要試劑包括RIPA裂解液(P0013B，碧云天)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0011，碧云天)、丙烯酰胺(0341-100G，Amresco)、甲叉丙烯酰胺(0172，Amresco)、PVDF膜(RPN303F，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、兔多抗GAPDH(yb-0755R，Abcam)、兔多抗Cx40(yb-465Hu01，Abcam)、鼠單抗Cx43(yb-277Bo01，Abcam)、鼠單抗Cx45(yb-480Gc01)。主要設(shè)備包括大鼠腦立體定向儀(ALC-H)、Aquapro超級(jí)純水儀(AJY-0502)、石蠟包埋機(jī)(KH-BL)、恒溫振蕩器(ZH-D)、光學(xué)顯微鏡(LWD200-37FT)、水平電泳儀(EBU-4000)、烘片機(jī)(KD-TH1)、離心機(jī)(TG16MW)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9245AE)等。

1.3 方法

1.3.1SAH模型建立和干預(yù)：(1)SAH模型組：根據(jù)改良版顱內(nèi)視交叉前池二次注血法建立SAH模型[6]。按體重350 mg/kg給予大鼠腹腔注射3%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉麻醉，進(jìn)行顱內(nèi)穿刺后借助注射器自股動(dòng)脈吸取0.2 mL新鮮股動(dòng)脈血，由PE10管滴注入蛛網(wǎng)膜下腔，骨蠟封閉骨窗，滅菌縫合后正常喂養(yǎng)，48 h后，再次向蛛網(wǎng)膜下腔注入0.2 mL自體動(dòng)脈血。建模后每天按體重10 mg/kg腹腔注射2%(體積分?jǐn)?shù))DMSO溶液，至模型建立后第7天。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠蛛網(wǎng)膜下腔存在大量紅細(xì)胞表明建模成功。(2)假手術(shù)組：往蛛網(wǎng)膜下腔注入等量生理鹽水，余步驟同SAH模型組。(3)對(duì)照組：不進(jìn)行任何操作。(3)干預(yù)組：在SAH模型操作的基礎(chǔ)上，按體重10 mg/kg腹腔注射含10 mg/mL 18β-GA的2%(體積分?jǐn)?shù))DMSO溶液，1次/d，共7 d。

1.3.2神經(jīng)行為評(píng)分：建模后第7天，采用Garcia神經(jīng)行為學(xué)法[7]對(duì)SD大鼠進(jìn)行評(píng)分：(1)自主活動(dòng)：正?；顒?dòng)3分，輕微影響2分，嚴(yán)重影響1分，不活動(dòng)0分；(2)提住鼠尾使大鼠四肢懸空：對(duì)稱3分，不對(duì)稱2分，偏癱1分；(3)握住鼠尾放置桌面邊緣：對(duì)稱3分，輕微不對(duì)稱2分，明顯不對(duì)稱1分，一側(cè)前肢無運(yùn)動(dòng)0分；(4)將大鼠置于鐵籠上：攀爬輕松，抓持有力3分，一側(cè)受損2分，不能攀爬或傾向于轉(zhuǎn)圈1分；(5)本體感覺反應(yīng)：雙側(cè)對(duì)稱3分，一側(cè)刺激遲鈍2分，一側(cè)無反應(yīng)1分；(6)觸碰兩側(cè)胡須觀察大鼠反應(yīng)：對(duì)稱3分，不對(duì)稱2分，無反應(yīng)1分。

1.3.3取材：建立模型后第7天，處死大鼠，留取軟腦膜動(dòng)脈、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)微動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，提取血管壁中的蛋白，均保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4軟腦膜直徑測定：在顯微鏡下用無齒眼科鑷留取額頂部軟腦膜動(dòng)脈，除去附在血管上蛛網(wǎng)膜，并用剪刀和鑷子仔細(xì)去除微動(dòng)脈周圍殘留的結(jié)締組織，進(jìn)行HE染色，采用Leica Biosystem掃描切片，再用K-Viewer軟件檢測軟腦膜直徑。

1.3.5壓力肌動(dòng)圖實(shí)驗(yàn)：按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行壓力肌動(dòng)圖實(shí)驗(yàn)檢測基底動(dòng)脈血管直徑。在顯微鏡下用無齒眼科鑷輕柔的去除大腦中動(dòng)脈及蛛網(wǎng)膜后，留取額頂部腦實(shí)質(zhì)的內(nèi)微動(dòng)脈，為確保實(shí)驗(yàn)精度，留取腦顳頂部皮質(zhì)下2 mm左右的實(shí)質(zhì)動(dòng)脈，借助視頻顯微測量法以及校準(zhǔn)視頻尺寸分析器對(duì)血管段進(jìn)行分析與測量。

1.3.6縫隙連接蛋白檢測：按文獻(xiàn)[9]方法取血管組織加入RIPA裂解液提取蛋白后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫，按1∶1000的比例稀釋一抗GADPH、Cx40、Cx43、Cx45；然后放在搖床上于室溫環(huán)境中進(jìn)行120 min孵育處理，接著和搖床一起置于冰箱(4 ℃)內(nèi)過夜孵育一抗，然后1×TBST洗膜處理后孵育二抗(1∶5000，由辣根標(biāo)記)，漂洗后進(jìn)行顯影、定影，采用蛋白免疫印跡檢測軟腦膜和基底動(dòng)脈處縫隙連接蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SSPS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(One way ANOVA analysis)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況假手術(shù)組死亡2只，對(duì)照組死亡3只，模型組死亡8只，干預(yù)組死亡5只，最終每組18只。

2.2 模型建立假手術(shù)組大鼠腦組織腹側(cè)Willis環(huán)周圍肉眼未見明顯血凝塊或積血，SAH模型組肉眼可見Willis環(huán)周圍及延髓處可見血凝塊或者積血。光學(xué)顯微鏡觀察顯示，假手術(shù)組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔未見紅細(xì)胞，SAH模型組可見大量紅細(xì)胞。表明SAH建模成功。結(jié)果見圖1。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分對(duì)照組、假手術(shù)組、SAH模型組和干預(yù)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SAH模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較假手術(shù)組低(P<0.05)，干預(yù)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較SAH模型組高(P<0.05)，對(duì)照組與假手術(shù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 動(dòng)脈直徑比較對(duì)照組、假手術(shù)組、SAH模型組和干預(yù)組大鼠軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈直徑比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與假手術(shù)組比較，SAH模型組軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈直徑均較細(xì)(P(0.05)；與SAH模型組比較，干預(yù)組軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈直徑均較粗(P<0.05)。結(jié)果見表1、圖2～3。

注：SAH：蛛網(wǎng)膜下腔出血，表1、圖2～6同；A、C：假手術(shù)組；B、D：SAH模型組 圖1 SD大鼠SAH造模全腦肉眼觀察結(jié)果(A、B)及蛛網(wǎng)膜下腔病理觀察結(jié)果(C、D，HE染色，比例R=250 μm)

組別n神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分軟腦膜動(dòng)脈直徑(μm)基底動(dòng)脈直徑(μm)對(duì)照組1817.00±0.6537.16±2.49337.29±19.87假手術(shù)組1817.00±0.6136.97±2.78335.61±20.16SAH模型組1811.20±1.47a26.67±3.15a259.38±37.02a干預(yù)組1813.50±1.32b33.17±2.83b312.16±29.17bF值5.3524.5263.625P值<0.01<0.05<0.05

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與SAH模型組比較，bP<0.05

2.4 縫隙連接蛋白表達(dá)各組SD大鼠軟腦膜動(dòng)脈處和基底動(dòng)脈處縫隙連接蛋白比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與假手術(shù)組比較，SAH模型組軟腦膜動(dòng)脈處和基底動(dòng)脈處Cx40蛋白表達(dá)水平較低，而Cx43和Cx45蛋白表達(dá)水平較高(均P<0.05)；與SAH模型組比較，干預(yù)組軟腦膜動(dòng)脈處和基底動(dòng)脈處Cx40蛋白表達(dá)水平較高，而Cx43和Cx45蛋白表達(dá)水平較低(均P<0.05)。結(jié)果見表2、圖4。

2.5 動(dòng)脈直徑與縫隙連接蛋白相關(guān)性分析SAH模型組大鼠軟腦膜動(dòng)脈直徑和基底動(dòng)脈直徑與Cx40均呈正相關(guān)(r=0.749，P<0.05；r=0.866，P<0.05)，而與Cx43和Cx45均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.836)，P<0.05；r=-0.697，P<0.05；r=-0.411，P<0.05；r=-0.979，P<0.05)。結(jié)果見圖5、6。

注：A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：SAH模型組；D：干預(yù)組 圖2 各組大鼠額頂部軟腦膜動(dòng)脈直徑(HE染色，×100)

注：A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：SAH模型組；D：干預(yù)組 圖3 顯微鏡下觀察各組大鼠額頂腦實(shí)質(zhì)基底動(dòng)脈血管直徑(×100)

表2 各組SD大鼠不同動(dòng)脈處縫隙連接蛋白水平比較

組別n軟腦膜動(dòng)脈處Cx40Cx43Cx45基底動(dòng)脈處Cx40Cx43Cx45對(duì)照組180.88±0.050.65±0.060.60±0.040.65±0.040.51±0.030.43±0.04假手術(shù)組180.88±0.040.65±0.050.59±0.050.65±0.050.50±0.040.42±0.05SAH模型組180.75±0.04a0.91±0.04a0.81±0.05a0.45±0.08a0.67±0.04a0.69±0.06a干預(yù)組180.81±0.07b0.81±0.08b0.74±0.07b0.61±0.06b0.58±0.05b0.51±0.03bF值13.5961.4768.57611.85115.71613.818P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖4 各組SD大鼠軟腦膜動(dòng)脈處(A)和基底動(dòng)脈處(B)縫隙連接蛋白水平(蛋白免疫印跡)

圖5 SAH模型組大鼠軟腦膜動(dòng)脈直徑與縫隙連接蛋白相關(guān)性分析

圖6 SAH模型組大鼠基底動(dòng)脈直徑與縫隙連接蛋白相關(guān)性分析

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，不同組織分布的血管以及不同類型的血管中縫隙連接蛋白表達(dá)水平不同，動(dòng)物種屬不同縫隙連接蛋白在血管壁內(nèi)的分布可能亦有所不同[10]。對(duì)于循環(huán)系統(tǒng)，Cx37所發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制為腎素分泌[11]。Cx37對(duì)血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊產(chǎn)生發(fā)揮關(guān)鍵性影響[12]。

本研究結(jié)果顯示，SAH模型組及經(jīng)18β-GA干預(yù)組大鼠軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈處Cx40蛋白表達(dá)情況均低于假手術(shù)組，表明SAH會(huì)導(dǎo)致大鼠軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈處Cx40蛋白表達(dá)水平降低。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲除Cx40的大鼠會(huì)發(fā)生高血壓以及無規(guī)律性動(dòng)脈收縮表現(xiàn)[13]。Cx40表達(dá)減弱時(shí)，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間通道機(jī)能減弱，使內(nèi)皮源性超級(jí)化因子穿過縫隙連接受限，進(jìn)而對(duì)平滑肌細(xì)胞舒張機(jī)能產(chǎn)生干擾[14]。還有研究證實(shí)，如將血管內(nèi)膜去除，則導(dǎo)致血管完全喪失舒張功能[15]。據(jù)此推測，對(duì)于CVS發(fā)生時(shí)Cx40具有保護(hù)效應(yīng)，在血管舒張方面發(fā)揮關(guān)鍵功能，然而其確切作用機(jī)制尚不清楚。

Cx43是縫隙連接蛋白的一種，其廣泛分布在多種組織器官中，特別是在血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞中表達(dá)最多，縫隙連接作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的主要形式之一，其若發(fā)生病理變化將會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。研究證實(shí)，細(xì)胞表面由Cx43組成的半通道可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)通訊，通常情況下半通道處于關(guān)閉狀態(tài)，可維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，而在一定條件下(如炎癥刺激、新陳代謝抑制等)半通道可被激活，使縫隙連接開放的扳機(jī)點(diǎn)觸發(fā)，從而打開縫隙連接通路，進(jìn)而使痙攣加劇，加速細(xì)胞死亡[16]。通過觀察敲除Cx45蛋白的大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠血管發(fā)生明顯失常改變，提高大鼠死亡概率[17]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH后軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈處Cx43和Cx45表達(dá)水平較高。據(jù)此推測，SAH后軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈處CX43蛋白表達(dá)水平升高，將會(huì)進(jìn)一步促使腦血管壁中細(xì)胞間收縮信號(hào)傳導(dǎo)增加，最終造成CVS的發(fā)生。目前尚缺乏有關(guān)SAH后腦血管內(nèi)Cx45變化的相關(guān)研究，SAH與腦血管內(nèi)Cx45的確切關(guān)系有待進(jìn)一步深入分析。

本研究通過分析軟腦膜血管直徑和基底動(dòng)脈血管直徑與縫隙連接蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，軟腦膜處和基底動(dòng)脈處Cx40表達(dá)與軟腦膜動(dòng)脈直徑和基底動(dòng)脈直徑均呈正相關(guān)，而Cx43和Cx45表達(dá)水平與兩動(dòng)脈直徑均呈負(fù)相關(guān)，提示軟腦膜動(dòng)脈處Cx40對(duì)緩解CVS起主要作用，而Cx43和Cx45升高可加重CVS。該研究結(jié)果顯示，SAH模型組大鼠經(jīng)縫隙連接蛋白非特異性阻斷劑18β-GA干預(yù)后，軟腦膜動(dòng)脈處和基底動(dòng)脈處Cx40蛋白表達(dá)水平較高，而Cx43和Cx45蛋白表達(dá)水平較低，從側(cè)面表明縫隙連接蛋白與CVS具有相關(guān)性。

綜上所述，大鼠SAH后，軟腦膜動(dòng)脈和基底動(dòng)脈縫隙連接蛋白發(fā)生改變，縫隙連接蛋白和CVS具有相關(guān)性，經(jīng)18β-GA干預(yù)后可緩解血管痙攣。深入研究縫隙連接蛋白表達(dá)和血管痙攣之間的相關(guān)性，可為今后腦血管病的防治奠定理論基礎(chǔ)。