劉孟楠，楊思進(jìn)，胡鐘競(jìng)，劉平，蒲玉婷

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生起始于血管內(nèi)皮損傷，而炎癥反應(yīng)存在于AS各個(gè)階段[1]。近年來(lái)研究報(bào)道細(xì)胞焦亡作為固有免疫的重要部分，參與AS的進(jìn)程并影響斑塊的穩(wěn)定性，因此減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞焦亡成為防治AS的重點(diǎn)[2]。核因子κB（NF-κB）是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了AS炎癥因子的表達(dá)。NOD樣受體（NLR）家族中的NLRP3炎性小體作為固有免疫的受體或感受器，它的活化將激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）依賴(lài)的細(xì)胞焦亡，引起炎性因子白介素1β（IL-1β）及白介素18（IL-18）的釋放從而起始AS的發(fā)生發(fā)展[2]。有研究表明，在高動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)如高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙的患者主動(dòng)脈中炎性小體的表達(dá)明顯增加[3]。因此，探究NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中的關(guān)系對(duì)于防治AS具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料清潔級(jí)新西蘭大白兔20只，體重1.6～2.2 kg，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。存放于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，光照12 h/d，室溫19℃～22℃，濕度40%～60%飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼料、高脂飼料均由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，蛋白裂解液（RIPA）（碧云天生物技術(shù)研究所，Beyotime Biotechnology，Shanghai，China）；Tris-Hcl，N a C l（生工生物工程（上海）股份有限公司，Shanghai，China）；PVDF膜（Millipore，Schwalbach，Germany）；p65抗體（pSer536）（stj28018，St John's Laboratory，London，United Kingdom）；p65抗體（arp38197_p050）、NLRP3抗體（arp63297_p050）、Caspase-1抗 體（a r p 5 8 9 8 3_p 0 5 0）、I L-1 β 抗 體（arp54323_p050），Aviva Systems Biology，San Diego，USA；IL-18抗體（paa064rb51 Cloud-Clone，Houston，USA）；β-actin 抗體（Sigma， A2228）；NF-κB ELISA試劑盒（abx362187，Abbexa，Cambridge，UK）；IL-1β ELISA 試劑盒（E-EL-RB0013，Elabscience Biotechnology，Wuhan，China）；IL-18 ELISA試劑盒（eku05257，Biomatik，Ontario，Canada）；Berthold LB941微孔板式多功能酶標(biāo)儀（Berthold公司）；Western blotting系統(tǒng)（MINI-PTET，COMP SYS，10W，1.0MM、POWERPAC HC POWER SUPPLY、SEMI DRY BLOT APPARATUS，Bio-Rad公司）；Tanon 6600發(fā)光成像工作站，Tanon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型將20只實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和模型組，每組各10只。對(duì)照組繼續(xù)正常喂養(yǎng)，模型組術(shù)前禁食12 h，不禁水，經(jīng)麻醉、頸部脫毛并清潔消毒后，作頸正中切皮，于甲狀軟骨上方分離左側(cè)約2.5 cm長(zhǎng)的頸總動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈兩端，在血管縱軸方向使用4.5號(hào)頭皮針穿刺進(jìn)入阻斷血管的兩端，生理鹽水沖洗置換出管腔內(nèi)的血液后，接上已調(diào)節(jié)好流量為250 ml/min的氣流，干燥內(nèi)皮5 min，然后將管腔內(nèi)充滿(mǎn)生理鹽水并恢復(fù)血供。濕潤(rùn)棉片輕壓止血后縫合皮膚創(chuàng)口并包扎[4]。術(shù)后肌注慶大霉素預(yù)防感染，使用由96%的普通飼料和2%的膽固醇以及2%的豬油配制而成的高脂飼料喂養(yǎng)4周建立兔高脂血癥勁動(dòng)脈粥樣硬化模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐手術(shù)的表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。

1.2.2 血脂檢測(cè)造模術(shù)后4周后處死實(shí)驗(yàn)家兔，股動(dòng)脈采血。血樣在室溫自然凝固，4℃ 3000 r/min離心10 min以分離血清。血脂采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。

1.2.3 頸動(dòng)脈組織HE染色分離1cm長(zhǎng)的頸動(dòng)脈組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm石蠟切片，將干燥的石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，下行梯度乙醇水化，蒸餾水洗加入蘇木精染色10 min，然后用流水沖洗并用鹽酸乙醇褪色，伊紅染色1 min，流水沖洗，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后進(jìn)行拍照。

1.2.4 NLRP3蛋白及相關(guān)炎癥因子檢測(cè)采用Westernblot 法檢測(cè)各組p-P65 NF-κB、p65 NFκB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18及IL-18蛋白質(zhì)表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定實(shí)驗(yàn)兔血清NFκB、IL-1β及IL-18活性，按照試劑盒說(shuō)明步驟操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況家兔的一般狀況良好，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物副作用的表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。正常組家兔飲食飲水可，自主活動(dòng)良好，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)較有光澤；模型組家兔飲食飲水可，精神狀態(tài)及反應(yīng)能力較正常組弱，自主活動(dòng)減少，毛發(fā)光澤度差。各組實(shí)驗(yàn)兔體重呈生理性增長(zhǎng)（表1）。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間體重比較（kg，±s）

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間體重比較（kg，±s）

給藥時(shí)間 正常組（10只） 模型組（10只） P值第0周 1.82±0.14 2.30±0.13 ＜0.001第2周 2.47±0.21 2.95±0.17 ＜0.001第4周 3.23±0.20 3.20±0.14 0.667

2.2 血脂與正常對(duì)照組比較，模型組 TC、TG水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示高脂血癥模型造模成功（表2）。

2.3 頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變?cè)炷?周后，光鏡下正常組頸動(dòng)脈內(nèi)皮完整，分界清晰，內(nèi)膜光滑，平滑肌細(xì)胞完整，排列整齊；模型組頸動(dòng)脈內(nèi)大量脂質(zhì)沉積并有向管腔內(nèi)凸起的斑塊，中膜內(nèi)層出現(xiàn)斷裂，平滑肌細(xì)胞顯著增生，可見(jiàn)由大量泡沫細(xì)胞構(gòu)成的脂質(zhì)斑塊，斑塊內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并有變性壞死，提示高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功（圖1）。

表2 各組實(shí)驗(yàn)家兔血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)家兔血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油

指標(biāo) 正常組（10只） 模型組（10只） P值TC 1.32±0.39 118.92±19.60 ＜0.001 TG 0.78±0.15 4.08±1.48 ＜0.001

2.4 實(shí)驗(yàn)兔頸動(dòng)脈組織焦亡指標(biāo)及炎性指標(biāo)的蛋白表達(dá)免疫印跡試驗(yàn)測(cè)得實(shí)驗(yàn)兔頸動(dòng)脈組織模型組p-P65 NF-κB、NLRP3、Caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β及IL-18 較正常值組表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；pro-Caspase-1較正常組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；P65 NF-κB的表達(dá)較正常組表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

2.5 實(shí)驗(yàn)兔血清炎性指標(biāo)的表達(dá)Elisa法測(cè)得實(shí)驗(yàn)兔血清模型組NF-κB、IL-1β及IL-18 較正常值組表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖3）。

圖1 頸動(dòng)脈病理變化（HE，×100）

圖2 頸動(dòng)脈組織中NLRP3 炎癥小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 血清炎性指標(biāo)的蛋白表達(dá)

3 討論

AS形成機(jī)制多樣，主要包括血管內(nèi)皮的損傷、脂質(zhì)代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)損傷、遺傳、物理化學(xué)損傷等。血管壁受到多種復(fù)雜因素的聯(lián)合作用，最終導(dǎo)致血管壁慢性炎癥的發(fā)生，AS在緩慢進(jìn)展中形成，而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制至今尚未確切闡明。在AS的發(fā)生過(guò)程中，頸動(dòng)脈是最易受累的部位，是反應(yīng)全身AS的一個(gè)窗口[1]。炎癥小體（Inflammasome）是一類(lèi)促炎性多蛋白復(fù)合體，其中NLRP3炎癥小體是目前研究中結(jié)構(gòu)和功能較為明確的炎癥小體，其作為固有免疫的重要組成部分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，研究表明NLRP3炎癥小體通過(guò)參與AS的形成并影響斑塊的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用[2]。激活的NLRP3炎性小體可以通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙誘導(dǎo)AS的發(fā)生，細(xì)胞焦亡的激活依賴(lài)于Caspase-1的調(diào)控，而Caspase-1的活化受到NLRP3炎性小體的調(diào)控[3]。NLRP3炎性小體的活化是AS形成所必須的，膽固醇晶體通過(guò)激活NLRP3炎性小體促進(jìn)血管內(nèi)皮的細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙誘導(dǎo)AS發(fā)生，并且有研究表明通過(guò)活化NF-κB的模式識(shí)別受體或細(xì)胞因子受體可以啟動(dòng)AS的形成[5]。

細(xì)胞焦亡依賴(lài)于Caspase-1的調(diào)控，并伴隨促炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放，進(jìn)而募集并激活其他免疫細(xì)胞并促進(jìn)下游炎癥因子、趨化因子、粘附因子等的表達(dá)，級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，IL-1β是動(dòng)脈斑塊形成初期重要的致炎因子，也是影響斑塊穩(wěn)定性重要因素[6]。有研究表明，大腦中動(dòng)脈栓塞腦缺血/再灌注模型大鼠體內(nèi)血清腦組織中NF-κB磷酸化水平升高，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)增加，NLRP3炎癥小體活化，通過(guò)抑制NF-κB磷酸化能降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18水平進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的活化[7]。王全河等[8]的研究表明，NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)水平及mRNA水平在高脂誘導(dǎo)大鼠冠狀動(dòng)脈硬化型心肌病模型中升高，提示NLRP3炎癥小體參與了該疾病模型的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，NF-κB 通路能夠活化NLRP3炎癥小體，激活的Caspase-1這一剪切修飾酶能夠促進(jìn)炎癥因子的釋放進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。

為了闡明NLRP3炎癥小體及相關(guān)信號(hào)途徑在AS中的發(fā)病機(jī)制及其焦亡的關(guān)系，并為臨床對(duì)AS的治療提供相關(guān)依據(jù)，本研究通過(guò)頸動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù)及高脂飼料喂養(yǎng)快速建立了高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型并對(duì)其進(jìn)行研究，在本研究中家兔高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化模型頸動(dòng)脈組織p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β及IL-18 蛋白較正常值組表達(dá)顯著上升，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。模型組頸動(dòng)脈組織p-P65 NF-κB/P65 NF-κB比值顯著上調(diào)，血清NF-κB、IL-1β及IL-18顯著上調(diào)，表明高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔NF-κB水平以及NF-κB磷酸化水平增加，NF-κB被激活，且NLRP3炎癥小體的激活也伴隨這下游相關(guān)炎癥因子的高表達(dá)。

本研究結(jié)果提示高脂血癥頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型存在NLRP3及其相關(guān)炎癥因子如Caspase-1、IL-1β和IL-18的高表達(dá)，且通過(guò)活化NLRP3炎癥小體促進(jìn)AS機(jī)制可能與NF-κB磷酸化有關(guān)。對(duì)NLRP3炎癥小體及NF-κB磷酸化的抑制可能成為治療AS相關(guān)疾病的手段，值得更深層次的研究。