王思婷，賈利蓉*，段飛霞，李大飛，張浩巖，田其明，鐘定江

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.麻江縣明洋食品有限公司，貴州 凱里 556000)

白酸湯起源于貴州省苗族侗族自治州，是一種以米漿為主要原料，經(jīng)乳酸發(fā)酵制成的調(diào)味品。貴州地區(qū)過(guò)去食鹽匱乏，當(dāng)?shù)厝藙?chuàng)造出“以酸代鹽”的調(diào)味方法，形成獨(dú)特的酸湯文化。傳統(tǒng)白酸湯的制作是將淘米水放在火塘邊自然發(fā)酵，隨用隨取，再不斷添加淘米水?，F(xiàn)代白酸湯工業(yè)生產(chǎn)是以米漿為原料，大型土壇為容器，采用5 d為1個(gè)周期的控溫發(fā)酵，每個(gè)周期結(jié)束時(shí)留存一部分酸湯作為發(fā)酵母液，形成循環(huán)發(fā)酵工藝[1]。白酸湯富含有機(jī)酸、礦物質(zhì)、乳酸菌等，具有解暑、刺激食欲、助消化、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用[2]。

目前，關(guān)于白酸湯的研究主要集中在微生物篩選、營(yíng)養(yǎng)研究等方面。陳大衛(wèi)等[3]從酸湯中分離篩選乳酸菌，成功篩選出2株菌株。石敏等對(duì)發(fā)酵過(guò)程中主要微生物種群及營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)主要菌群為乳桿菌、醋酸桿菌和酵母菌。對(duì)于白酸湯的揮發(fā)性成分，尤其是不同發(fā)酵階段揮發(fā)性成分的變化研究，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。白酸湯的工業(yè)生產(chǎn)目前尚處于起步階段，其品質(zhì)主要通過(guò)感官和總酸含量來(lái)評(píng)估。本文采用GC-MS對(duì)不同發(fā)酵階段的白酸湯揮發(fā)性成分進(jìn)行跟蹤研究，旨在探究白酸湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化規(guī)律，為提升產(chǎn)品質(zhì)量和促進(jìn)白酸湯工業(yè)化發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凱里白酸湯取自貴州凱里麻江縣明洋食品有限公司的酸湯生產(chǎn)基地，以無(wú)菌操作收集發(fā)酵1，2，3，4，5 d的樣品，取樣時(shí)先將白酸湯攪動(dòng)均勻后靜置2 h，將樣品置于-20 ℃冰箱中待分析測(cè)定。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 Plus GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm，0.25 μm) 日本島津公司；SPME裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；15 mL頂空樣品瓶；HH-ZK1單孔恒溫水浴鍋 上海一科儀器有限公司；FA 1004型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

先將纖維頭在進(jìn)樣口于250 ℃老化10 min至無(wú)雜峰，取發(fā)酵1，2，3，4，5 d的白酸湯樣品8 mL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入2.5 g NaCl 密封。50 ℃下平衡20 min，將固相微萃取頭(SPME)插入進(jìn)樣瓶中，纖維頭不能直接接觸液面。吸附40 min后收回纖維頭，取出萃取頭。將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)進(jìn)樣口，推出纖維頭，于250 ℃解吸5 min。

1.3.2 SPME-GC/MS檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)

揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)條件在 Lee Su-Won等[4]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。

1.3.2.1 GC條件

DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣方式不分流，以氦氣(純度：99.999%)為載氣，流速為1 mL/min。檢測(cè)器溫度250 ℃，程序升溫：35 ℃保持8 min；以5 ℃/min升至150 ℃；以6 ℃/min升至210 ℃，保持1 min。

1.3.2.2 MS條件

接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃，電離方式EI+，電子能量70 eV；掃描范圍30～450 amu。

1.3.3 定性定量方法

將每種揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)NIST 11 Library進(jìn)行比對(duì)，選擇相似度大于85的物質(zhì)進(jìn)行分析，并比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的定性。各揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量使用峰面積歸一化計(jì)算。對(duì)定性確定的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，得到不同發(fā)酵階段白酸湯風(fēng)味上的差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2016、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)鑒定結(jié)果

用SPME-GC/MS對(duì)白酸湯不同發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分析，得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量及種類見(jiàn)表1。

表1 不同發(fā)酵階段的白酸湯中揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量Table 1 The types and relative content of volatile compounds in RSS at different fermentation stages

續(xù) 表

注：“—”表示未檢出。

由表1可知，白酸湯在各個(gè)發(fā)酵階段共檢測(cè)到40種化合物，主要為酸、醇、酯、醛、酮、酚和萜烯等。其中，白酸湯發(fā)酵1 d檢測(cè)出26種化合物，發(fā)酵2 d檢測(cè)出27種，發(fā)酵3 d檢測(cè)出32種，發(fā)酵4 d檢測(cè)出33種，發(fā)酵5 d檢測(cè)出30種化合物。5組樣品中相對(duì)含量較高的物質(zhì)主要有乙酸、丙酸、乳酸、乙醇、正丙醇、乙酸丙酯、丙酸丙酯和乳酸異丙酯、α-松油醇、(-)-4-萜品醇、芳樟醇等。不同的發(fā)酵階段共同含有的物質(zhì)有18種，風(fēng)味物質(zhì)的種類差異不明顯，這可能與白酸湯獨(dú)特的循環(huán)發(fā)酵方式有關(guān)，每輪發(fā)酵后以3/4上清液為成品，1/4沉淀物為下一輪發(fā)酵的起子。總體而言，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵過(guò)程中，酸類、醇類、酯類、醛類的種類數(shù)量和相對(duì)含量隨發(fā)酵進(jìn)行緩慢增加；酚類物質(zhì)和萜烯類的相對(duì)含量先增加后降低，萜烯類種類數(shù)量則先增加后減少。發(fā)酵3 d和4 d的白酸湯中風(fēng)味物質(zhì)最為豐富，分別有32種物質(zhì)(相對(duì)含量為99.071%)和33種物質(zhì)(相對(duì)含量為99.002%)。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中各類揮發(fā)性物質(zhì)的變化

白酸湯的發(fā)酵主要包括三個(gè)階段，第一階段是淀粉糖化；第二階段是酒精發(fā)酵，主要通過(guò)酵母菌將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為醇類物質(zhì)；第三階段是乙酸發(fā)酵，它是由醋酸菌將醇類物質(zhì)氧化為酸類物質(zhì)的過(guò)程[5]。發(fā)酵食品的香氣成分主要來(lái)源于原料和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。與泡菜、紅曲糯米酒及米醋等發(fā)酵食品相比，白酸湯的風(fēng)味物質(zhì)較少[6]，原因可能是原料只有糯米比較單一且發(fā)酵時(shí)間較短。

發(fā)酵過(guò)程中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量和相對(duì)含量的變化情況見(jiàn)表2。對(duì)比可知，發(fā)酵前后白酸湯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量存在顯著差異。在檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中醇類物質(zhì)種類最多、含量最高，其次是酸類、酯類和萜烯類物質(zhì)。這4種物質(zhì)在揮發(fā)性物質(zhì)中占主導(dǎo)地位，其含量占總揮發(fā)性化合物的98%以上。

表2 白酸湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量Table 2 The types and relative content of volatile flavor compounds in RSS during fermentation process

2.2.1 醇類物質(zhì)

醇類物質(zhì)主要來(lái)自于淀粉糖化后的酒精發(fā)酵階段，發(fā)酵中期各類微生物生長(zhǎng)繁殖較快，產(chǎn)生大量醇類物質(zhì)，共同作用促進(jìn)香氣的形成，并且為有機(jī)酸提供前體物質(zhì)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，共鑒定出13種醇類，占總揮發(fā)性物質(zhì)的61%以上。發(fā)酵1 d的白酸湯樣品有醇類9種，發(fā)酵到第3天時(shí)為10種。相對(duì)含量從第1天的60.455%開(kāi)始增加，到第3天時(shí)略有下降，隨后繼續(xù)增加。醇類物質(zhì)的產(chǎn)生主要是乳酸菌、酵母菌等微生物利用糖類代謝產(chǎn)生，同時(shí)醇類可與酸類物質(zhì)生成酯類，可能是第3天相對(duì)含量有所下降的原因。其中，正丙醇在所有醇類中的比例最高，其次是乙醇、葑醇和2-茨醇，這些物質(zhì)賦予白酸湯獨(dú)特的香氣。其中正丙醇是在酒精發(fā)酵過(guò)程中形成的一種高級(jí)醇，具有水果、清潔和新鮮草木的風(fēng)味[7]，是中國(guó)白酒、啤酒及葡萄酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)。其相對(duì)含量從發(fā)酵第1天的54.314%逐漸上升至第5天的55.835%。乙醇能夠賦予白酸湯清香味，相對(duì)含量從發(fā)酵第1天的4.411%逐漸增加，隨后在第4天下降至4.076%。這些醇類物質(zhì)還能與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)為白酸湯的香氣做出一定貢獻(xiàn)。

2.2.2 酸類物質(zhì)

酸類物質(zhì)是白酸湯中第二大類風(fēng)味物質(zhì)，共檢測(cè)出9種酸，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的13%左右，對(duì)白酸湯的呈味和呈香都起著重要作用。由表2可知發(fā)酵1 d的白酸湯含6種酸類，隨發(fā)酵時(shí)間增加，在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最多為，8種，整體呈正態(tài)分布，這可能與微生物生長(zhǎng)的趨勢(shì)有關(guān)。在發(fā)酵第3天時(shí)，產(chǎn)酸較多，之后隨著生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率受到抑制，產(chǎn)酸開(kāi)始降低。在檢測(cè)出的酸類物質(zhì)中，乙酸含量最高，其次為乳酸、異戊酸。乙酸的相對(duì)含量隨發(fā)酵時(shí)間逐漸增加，第5天時(shí)最高，為13.276%。同時(shí)乙酸的揮發(fā)性較強(qiáng)，對(duì)白酸湯酸味貢獻(xiàn)很大。乳酸相對(duì)含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，發(fā)酵3 d時(shí)最高，為2.167%。乳酸可以賦予白酸湯清淡的香味，同時(shí)還能在酶的催化作用下與醇類結(jié)合形成乳酸異丙酯，進(jìn)一步豐富白酸湯的風(fēng)味。丁酸、正戊酸僅在發(fā)酵第3天檢測(cè)到，說(shuō)明第3天時(shí)白酸湯風(fēng)味物質(zhì)種類和數(shù)量最為豐富的時(shí)期。其中正戊酸為酸臭味，可能是白酸湯酸餿味的來(lái)源。乳酸菌利用五碳糖、六碳糖，通過(guò)糖代謝等途徑產(chǎn)生乳酸、乙酸、異戊酸等有機(jī)酸[8]。酸類除了本身可以呈味，還能與醇類反應(yīng)生成酯類，構(gòu)成白酸湯獨(dú)特的酸香風(fēng)味，同時(shí)也賦予白酸湯營(yíng)養(yǎng)保健功能，如調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。成熟白酸的湯pH為3.03～3.35，這樣的酸度環(huán)境能保留大多數(shù)感官氣味和揮發(fā)性化合物，抑制病原菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。

2.2.3 酯類物質(zhì)

酯類是白酸湯中種類和相對(duì)含量第三豐富的物質(zhì)，酯類相對(duì)含量從1 d的14.784%逐漸增加至3 d的15.517%。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共鑒定出4種酯類，占總體的14%左右。其中乳酸異丙酯是最豐富的酯，其次是乙酸丙酯和丙酸丙酯。酯類來(lái)自醇類的酯化反應(yīng)，酯類物質(zhì)多具有水果般香氣，且具有高揮發(fā)性和低閾值的特點(diǎn)，是發(fā)酵食品中最重要的揮發(fā)性氣味成分之一[9]。從感官特性上看，乙酸丙酯有強(qiáng)烈的果香和酒香，并有獼猴桃、菠蘿、香蕉香氣。主要用于制造食用香料，并且在中國(guó)醋的香氣成分中也有檢測(cè)到[10]。

2.2.4 其他物質(zhì)

醛類具有閾值低、賦予香氣能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在白酸湯中只有4種，且含量較低。其中壬醛呈苦杏仁味，發(fā)霉味，可能會(huì)對(duì)整體風(fēng)味有不良影響。癸醛表現(xiàn)為甜橙和橘子香氣、青香和脂肪香[11]。苯乙醛具有獨(dú)特的香味，具有玫瑰香、桂花香、紫羅蘭香和茉莉花香等多樣的風(fēng)味，對(duì)醬油風(fēng)味也有較大貢獻(xiàn)[12]，這些醛類物質(zhì)在白酸湯的風(fēng)味特征中起重要作用。甲基庚烯酮具有新鮮的青香、柑橘樣香氣。萜烯類物質(zhì)在白酸湯發(fā)酵過(guò)程中屬于第四大類。發(fā)酵第3天時(shí)，α-松油醇和(-)-4-萜品醇含量最豐富，分別達(dá)到7.052%和2.730%。橙花醇具有令人愉悅的玫瑰香氣，異戊醇具有蘋(píng)果白蘭地香氣和辛辣味。(-)-4-萜品醇具有胡椒香氣，含量先增加后減少，可能與發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)有關(guān)。α-松油醇具有紫丁香花樣香氣，是茶的主要風(fēng)味成分之一[13]。芳樟醇具有酸味、花香、新鮮的風(fēng)味，也是泡菜中占比較大的物質(zhì)[14]。右旋萜二烯有似鮮花的清淡香氣[15]，含量較低，但香氣閾值極低(41 μg/kg)，故對(duì)白酸湯風(fēng)味有一定補(bǔ)充作用。2-壬酮、環(huán)已酮等酮類物質(zhì)以及1,4-桉葉素和右旋萜二烯等都在發(fā)酵中后期被檢測(cè)到，表明風(fēng)味物質(zhì)的形成更多在發(fā)酵后期。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

將白酸湯發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)到的各種風(fēng)味物質(zhì)作為自變量，對(duì)其進(jìn)行主成分分析，得出主成分的相關(guān)矩陣特征值、方差貢獻(xiàn)率以及累計(jì)貢獻(xiàn)率。

表3 主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of principal components

以主成分特征根大于1和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85%為篩選標(biāo)準(zhǔn)，由表3可知，前3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為41.441%、27.774%、19.267%，累計(jì)達(dá)到88.482%，即涵蓋了大部分信息，表明前3個(gè)主成分能夠比較客觀反映白酸湯發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律。

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

續(xù) 表

白酸湯中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)主成分的影響大小體現(xiàn)在各主成分的載荷系數(shù)，因子負(fù)荷矩陣負(fù)荷越大，表明主成分對(duì)該變量的代表性越強(qiáng)[16]。由表4可知，第一主成分與丁酸、乳酸、戊酸、2-乙基己醇、正辛醇、芳樟醇、葑醇、α-松油醇、(-)-4-萜品醇、2-壬醇、橙花醇、2,3-丁二醇、丙酸丙酯等有比較強(qiáng)的相關(guān)性，對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)有異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、己酸、乙烯二乙酯、苯乙醛、甲基庚烯酮。對(duì)第三主成分貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)有乙醇、乙酸丙酯。因主成分1，2，3貢獻(xiàn)了85%以上的總方差，可認(rèn)為以上22種物質(zhì)為白酸湯發(fā)酵過(guò)程中主要的風(fēng)味物質(zhì)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得出各樣品的主成分值，進(jìn)一步計(jì)算出綜合得分，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 主成分綜合得分Table 5 The comprehensive scores of principal components

綜合得分反映了白酸湯的嗅聞強(qiáng)度，得分越高表明此時(shí)樣品中所含有的風(fēng)味物質(zhì)和整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的香味物質(zhì)越接近，此時(shí)的白酸湯風(fēng)味最佳。由表5可知，隨著白酸湯發(fā)酵的進(jìn)行，綜合得分從第1天的-2.49逐漸上升至最高，第3天的2.55。對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)表明，發(fā)酵第3天的白酸湯風(fēng)味最佳。主要與白酸湯中微生物的生長(zhǎng)規(guī)律有關(guān)，發(fā)酵前期微生物主要進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，到發(fā)酵后期微生物的數(shù)量和種類增多后，產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)醇類、酸類和酯類的種類和含量也較多，因此發(fā)酵第3天的白酸湯樣品綜合得分最高。

3 結(jié)論

本文利用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定白酸湯發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及種類變化規(guī)律，共檢測(cè)到40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酸類9種、醇類13種、酯類4種、醛類4種、酮類3種、酚類1種和萜烯類6種。其中醇類、酯類、酸類和萜烯類物質(zhì)是最主要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的98%以上。發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的種類沒(méi)有顯著變化，在1～5 d的發(fā)酵過(guò)程中分別檢測(cè)到26，27，32，33，30種，相同的物質(zhì)有19種，可能與采用循環(huán)發(fā)酵工藝有關(guān)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酸類、醇類、酯類和醛類的種類數(shù)量和相對(duì)含量隨發(fā)酵進(jìn)行緩慢增加；酯類、酚類物質(zhì)和萜烯類的相對(duì)含量先增加后降低，萜烯類的種類數(shù)量則先增加后減少。

通過(guò)SPSS軟件對(duì)所有揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，得到了22種主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵3 d的白酸湯綜合得分最高。所有風(fēng)味物質(zhì)中，乙醇、葑醇、2-乙基己醇、正辛醇、2-壬醇等醇類物質(zhì)，萜烯類物質(zhì)中的芳樟醇、α-松油醇、和(-)-4-萜品醇、橙花醇，酸類物質(zhì)中的乳酸、乙酸、丁酸、戊酸，酯類中的丙酸丙酯、乙酸丙酯等是對(duì)白酸湯風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)。乳酸菌，醋酸菌等微生物利用淀粉生成乳酸、丙酸、乙酸以及酯類、醇類、醛類、酮類等，這些物質(zhì)共同形成白酸湯的酸香味。白酸湯的風(fēng)味與原料、發(fā)酵方法、微生物種類及多樣性息息相關(guān)，本次實(shí)驗(yàn)研究了白酸湯發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)變化規(guī)律和特點(diǎn)，所得到的數(shù)據(jù)和結(jié)論對(duì)科學(xué)評(píng)估白酸湯的產(chǎn)品品質(zhì)、促進(jìn)白酸湯工業(yè)發(fā)展具有重大意義。