董若曦, 朱小丹, 樊伯珍, 許文娟

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院, 上海 200032;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院婦產(chǎn)科, 上海200062;3.安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀中心臨床學(xué)院婦產(chǎn)科，上海 200062)

卵巢早衰(POF)是由多因素導(dǎo)致的卵巢功能提前減退的一種常見婦科內(nèi)分泌疾病，一般定義為女性在40歲以前因卵巢卵泡耗竭引起的閉經(jīng)、不孕、雌激素過少和促性腺激素水平升高等[1]。順鉑(cisplatin，CP)是腹腔化療的常用藥物，CP 可誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞凋亡引起組織壞死, 從而導(dǎo)致卵巢功能早衰[2]。關(guān)于CP 腹腔注射建立POF 大鼠模型，目前文獻(xiàn)[3]中多采用小劑量連續(xù)注射或大劑量間隔注射。本實(shí)驗(yàn)旨在嘗試不同時間點(diǎn)、不同劑量的CP 腹腔注射，以求建立更合適的POF 大鼠模型，以供實(shí)驗(yàn)研究使用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級未交配雌性Wistar大鼠50只，8周齡,體質(zhì)量 (220±10) g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005], 飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物房[SYXK(滬)2013-0055]。予全價營養(yǎng)飼料, 保持室溫在22～25 ℃，相對濕度在35%～55%，模擬正常晝夜生理節(jié)律，予12 h 光照，自由飲水和進(jìn)食。所有動物實(shí)驗(yàn)研究均符合上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則 (倫理批號PTEC-B-2017-9-3) 。

1.2 主要試劑和設(shè)備

注射用CP(凍干型)購自中國齊魯制藥有限公司生產(chǎn), 注射前用37 ℃生理鹽水配成1 mg/mL 的新鮮水溶液備用; 大鼠抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone, AMH) ELISA 試劑盒(EK-R30586)由Abcam 公司生產(chǎn)，上海酶研生物有限公司進(jìn)口分裝。Thermo Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司; Leica EG1150 包埋機(jī)、Leica RM2235 切片機(jī)、Leica HI1210 攤片機(jī)、Leica HI1220 烘片機(jī)、Leica CV5030 全自動玻璃蓋片機(jī)和Leica ST5010 病理染色機(jī)均購自德國Leica Biosystems Nussloch GmbH公司； BX43顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 大鼠行為學(xué)觀察

造模后，每日對比觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、被毛光澤、對外界的反應(yīng)和進(jìn)食量等情況。

1.4 大鼠體質(zhì)量變化觀測

自造模之日起，每日對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量并記錄，比較各組大鼠在造模各階段的體質(zhì)量變化情況。

1.5 大鼠動情周期觀察

50 只雌性Wistar 大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，每日8∶00—9∶00 陰道涂片法觀察各組大鼠的動情周期，持續(xù)4 周。

大鼠完整的動情周期主要分為：動情前期、動情期、動情后期和動情間期[4]。動情前期：大鼠處于卵泡發(fā)育期；動情期間：卵泡發(fā)育成熟并在動情期末排卵；動情后期：卵巢內(nèi)黃體形成；動情間期：陰道涂片見大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞。大鼠正常的動情周期為4～5 d[5]，動情周期持續(xù)時間大于5 d 或小于4 d，均被認(rèn)為動情周期不正常。

1.6 動物分組、模型建立及給藥

50 只雌性Wistar 大鼠排除無明顯動情周期2只，共計48 只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6 組，每組8 只(表1)。

1.7 動物處理及留取標(biāo)本

表1 動物分組及給藥方案

各組大鼠于造模結(jié)束后24 h稱重，腹腔注射0.6 mL 戊巴比妥那進(jìn)行麻醉，腹主動脈取血處死。血液收集于15 mL 離心管中，室溫下靜置2 h 后，3 000 r/min 離心15 min。分裝血清，每500 μL 一管，-80 ℃冰箱凍存。腹主動脈取血后，取大鼠雙側(cè)卵巢，將周圍脂肪組織剝離干凈，一側(cè)卵巢置于凍存管中，置于-80 ℃冰箱凍存。另一側(cè)卵巢用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液固定至少24 h 后，洗滌，依次梯度乙醇脫水，于二甲苯中透明15 min，石蠟包埋后切片，烤干，脫蠟后再依次梯度乙醇脫水，蘇木精對比染色，鹽酸乙醇分化，行HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察不同組別卵巢組織的病理學(xué)改變，計算卵泡內(nèi)各級卵泡的數(shù)量。雙盲法評定，隨機(jī)選取5個不同的視野，計算卵泡數(shù)量。

1.8 血清AMH 濃度測定

按試劑盒說明書操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析均使用SPSS 21.0 軟件，以x-± s表示各組計量資料，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。先檢查數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布時，均數(shù)間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)；當(dāng)兩組之間方差齊時，則使用LSD 檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時，采用Games-Howell 檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)前后對比, 對照組大鼠無明顯異常表現(xiàn)，精神狀態(tài)良好, 進(jìn)食量無明顯變化, 活動敏捷, 皮毛光滑。予CP 腹腔注射的各組大鼠，隨著給藥時間的推移，絕大部分進(jìn)食逐漸減少，形體逐漸消瘦，反應(yīng)遲鈍，對外界反應(yīng)淡漠，皮毛暗淡，毛發(fā)蓬松。至給藥結(jié)束時，6 組大鼠均未出現(xiàn)死亡。

2.2 動情周期變化情況

如圖所示，動情前期涂片可見較多有核上皮細(xì)胞，少見白細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞，背景較暗淡，雜質(zhì)相對較多(圖1A); 動情期涂片可見滿視野角化上皮細(xì)胞，背景較清晰(圖1B); 動情后期白細(xì)胞、不規(guī)則角化上皮細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞均可見，白細(xì)胞相對較多，背景較清晰(圖1C); 動情間期，涂片以白細(xì)胞為主，細(xì)胞體積小，偶見極少量的有核上皮細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞，白細(xì)胞顏色較深(圖1D)。剔除無規(guī)律動情周期的大鼠2 只后，各組大鼠CP 腹腔注射前動情周期規(guī)律，周期一般為4～5 d。用藥后，A 組大鼠動情周期無明顯變化，而CP 腹腔注射各組大鼠動情周期均出現(xiàn)紊亂，周期延長至8～11 d，甚至無明顯動情周期。

2.3 體質(zhì)量變化情況

圖1 大鼠動情周期涂片(亞甲藍(lán)染色 40×)

造模結(jié)束后，各給藥組大鼠體質(zhì)量均低于對照組(P<0.05)。其中小劑量給藥組(B、C、D 組)組間比較，大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 與大劑量給藥組(E、F 組)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

2.4 不同劑量CP腹腔注射對大鼠血清AMH指標(biāo)的影響

與A 組比較，腹腔注射不同劑量CP 的各組大鼠血清的AMH 含量均有不同程度降低，其血清AMH 含量組間差異顯著，證明造模成功，E組和F 組的AMH 下降更為明顯(表3)。

2.5 卵巢病理學(xué)改變及各級卵泡數(shù)

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況 (g)

表3 各組大鼠血清AMH 變化情況 (μg/L)

2.5.1 各組大鼠卵巢大體肉眼觀 A 組大鼠卵巢形態(tài)正常，卵巢周圍可見光亮脂肪包繞，表面光滑，無明顯異常改變; 各CP 腹腔注射組可見卵巢體積明顯縮小，脂肪組織減少，卵巢顏色變深，表面粗糙。部分大鼠卵巢可見有紫紅色壞死灶。

2.5.2 各組大鼠卵巢組織病理學(xué)改變 鏡下觀測A 組大鼠卵巢切片：卵巢皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，可見原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、黃體分布。各期卵泡的形態(tài)和數(shù)量正常，血管豐富(圖2A)。各C P 腹腔注射給藥組大鼠卵巢切片：卵巢萎縮，各期卵泡數(shù)均明顯減少，其中生長卵泡和成熟卵泡的數(shù)量下降明顯，甚至消失， 可見黃體退化等(圖2B～F)。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理改變(HE, 比例尺100 μm)

2.5.3 各組大鼠卵巢各級卵泡計數(shù) 與A組相比,各組給藥組大鼠卵巢總卵泡數(shù)均有顯著下降(P<0.05)，但腹腔注射CP 小劑量組與A 組相比，原始卵泡降低水平不如腹腔注射CP 高劑量組。原始卵泡數(shù)：與A 組相比，B 組卵泡數(shù)P<0.05，其余組P<0.01，均有統(tǒng)計學(xué)意義；但CP 腹腔注射小劑量組與A 組相比，原始卵泡降低水平不如CP 腹腔注射高劑量組。生長卵泡數(shù)：與A 組相比，各組大鼠卵巢生長卵泡數(shù)均有顯著下降，P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。但CP 腹腔注射小劑量組與A 組相比，原始卵泡降低水平不如CP 腹腔注射高劑量組。成熟卵泡數(shù)：與A 組相比，B組和C 組，P<0.05，其余組P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義；CP 腹腔注射小劑量組與A 組相比，成熟卵泡降低水平不如CP 腹腔注射高劑量組(表4)。

3 討論

POF 在臨床上有多種致病因素，最主要的相關(guān)因素有：老齡化、婦科手術(shù)、放化療、吸煙、感染、遺傳、環(huán)境因素及免疫抑制劑和自身免疫性疾病等[6-7]。醫(yī)源性因素主要是指化療、放療及手術(shù)對卵巢的損傷[8]。化療損傷是醫(yī)源性卵巢功能衰退的主要原因。CP 作為婦科常用的化療藥物，已被廣泛應(yīng)用于各種腹腔化療中。研究[9]表明，CP 在多種癌癥治療過程中均表現(xiàn)出優(yōu)良的抗腫瘤活性，但CP 亦可對卵巢產(chǎn)生損傷作用，進(jìn)而誘發(fā)PO F。

表4 各組大鼠卵巢內(nèi)各期卵泡數(shù)

關(guān)于POF的動物模型，目前國際上尚無通用的標(biāo)準(zhǔn)，多用雷公藤多苷、環(huán)磷酰胺、CP 等制作POF 模型[10]，造模劑量各有不同，且選用的造模持續(xù)時間也有較大差異。本實(shí)驗(yàn)旨在用不同劑量的CP 行腹腔注射不同時間點(diǎn)，以建立更適宜的大鼠化療損傷性POF 模型。AMH 是轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β) 超家族成員之一，由卵巢竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生。AMH水平不受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控，具有良好的周期內(nèi)和周期間穩(wěn)定性[11]，近年來被認(rèn)為是能更直接地反映卵巢儲備功能的指標(biāo)。

綜上所述，POF的病因主要是原始卵泡儲備過少，卵泡閉鎖或耗竭太快[12]。本實(shí)驗(yàn)研究了CP 不同時間、不同劑量腹腔注射后大鼠的一般情況、動情周期變化、卵巢病理學(xué)、卵泡數(shù)量及體內(nèi)激素水平等變化，為模擬化療損傷性POF提供了詳細(xì)的大鼠動物模型參考。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，CP 腹腔注射不同的劑量后，各組大鼠體質(zhì)量均明顯下降，呈不同程度的蜷縮不喜動、進(jìn)食量下降, 被毛晦暗無光澤等，整體狀態(tài)較差。此外，陰道涂片也顯示大鼠動情周期紊亂; 血清AMH 指標(biāo)顯著降低，各級卵泡數(shù)明顯下降。其中，CP 腹腔連續(xù)注射小劑量3 組(B、C、D 組)，對大鼠體質(zhì)量和血清AMH 及卵泡數(shù)量的影響不如CP 腹腔注射大劑量組效果好；CP 腹腔注射大劑量2 組中的E 組，即間隔1 周2 次CP 4 mg/kg 腹腔注射的造模方式，其大鼠的體質(zhì)量變化、血清AMH、卵巢病理切片、及卵泡數(shù)量下降最為明顯，各級卵泡分布更加均衡，成模更理想，卵巢組織的病理學(xué)改變與臨床病理更為一致，可認(rèn)為是更適宜的POF 造模方法。