王 吉, 王莎莎, 付 瑞, 王淑菁, 李 威, 秦 驍,黃宗文, 李曉波, 鞏 薇, 岳秉飛, 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實驗動物微生物遺傳檢測中心, 北京 102629)

小鼠肝炎病毒(MHV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬。MHV基因組為線性不分段的單股正鏈RNA。病毒粒子呈圓形或多形態(tài), 直徑80～160 nm, 外有囊膜[1-4]。根據MHV 嗜組織特性的不同，可將其分為呼吸株(Respiratory MHV strain)和嗜腸株(Enterotropic MHV strain)兩型[5-6]。MHV 感染臨床表現為肝炎、腦炎和腸炎，并可通過胎盤垂直傳播[7-8]。MHV 呈世界范圍性分布, 無明顯的季節(jié)性, 對鼠群的危害極大, 嚴重影響實驗和生產[1,8-9]。

裸鼴鼠是主要產于非洲肯尼亞、埃塞俄比亞等地的嚙齒類動物，由于其具有抗衰老、耐低氧、抗腫瘤、耐疼痛等方面的特性，目前廣泛用于腦神經、抗氧化、自噬、腫瘤等方面的研究[10-12]。但裸鼴鼠質量控制沒有標準化，嚴重制約了在各個領域的應用。本文旨在建立簡單、快速、特異、敏感的MHV熒光定量PCR檢測方法，開展對裸鼴鼠攜帶MHV 情況本底篩查，為裸鼴鼠微生物質量控制標準的制定提供依據。同時，建立的方法亦可用于小鼠、沙鼠、黃鼠(Citellus dauricus)等嚙齒類動物攜帶MHV的檢測，不但為保證上述動物安全使用性提供質量控制手段，同時為上述動物的標準化研究及微生物質量控制標準的制修訂提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病毒及動物

MHV-V1、小鼠仙臺病毒(SV)、呼腸孤病毒3 型(Reo3)、牛冠狀病毒(BCV)為本單位保存；小鼠肺炎病毒(PVM)購自美國ATCC(編號: VR-25)。63 只14～34 月齡屏障環(huán)境飼養(yǎng)裸鼴鼠，體質量22～42 g, 雌性31 只，雄性32 只，海軍軍醫(yī)大學提供，飼養(yǎng)于屏障設施[SYXK(滬)2017-0004];成年小鼠、長爪沙鼠、金黃倉鼠、黃鼠來自國內9 個送檢單位，福利倫理審批文件編號為中檢動(福)第2019(A)001 號。所有動物均按3R 原則給予人道的關懷。具體信息見表1。

表1 檢測動物信息Table 1 The information of testing animal

1.2 主要試劑及儀器

核酸提取試劑盒購自德國Qiagen 公司；反轉錄試劑盒購自Thermo 公司；pGEM T Easy 質粒購自Promega 公司；TaqMan Gene Expression Master Mix 購自美國ABI 公司；PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；熒光定量PCR 儀(7500fast Real-Time PCR System)購自美國Applied Biosystems 公司。

1.3 TaqMan探針及引物的設計

將不同株MHV病毒序列進行比對，選擇E基因(序列號：FJ 64 72 23)保守區(qū)域，采用AB I PrimerExpress 3.0 實時熒光定量PCR 引物設計軟件，設計合成TaqMan 探針及引物。探針的熒光標記選擇FAM(5’端)作為報告發(fā)光基團, NFQ(3’端)為淬滅基團，擴增引物和探針委托美國ABI 公司合成[13-14]，序列如表2。

1.4 質粒標準品的制備

人工合成MHV(FJ647223)基因組第28 775～29 031 位DNA 序列，轉入pMD19-T 質粒中，作為MHV 質粒標準品[13-15]。

1.5 病毒RNA/DNA 提取

按照核酸提取試劑盒操作步驟提取MHV感染小鼠星形膠質瘤(DBT)細胞毒、SV、Reo3、PVM、BCV和正常DBT細胞RNA或DNA。提取的RNA應立即進行反轉錄。

1.6 反轉錄

按反轉錄試劑盒操作步驟進行。反轉錄獲得cDNA, 凍存于-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表2 用于擴增E 基因的引物與TaqMan 探針序列Table 2 The sequences of primers and TaqMan probes of used for amplification of E gene

1.7 擴增體系確定及標準曲線的建立

通過優(yōu)化在熒光定量PCR反應體系中使用的探針和引物濃度，確定最佳反應條件，建立實時熒光定量PCR 檢測方法[13,15-16]。

在96 孔板中按Mix 10 μL、滅菌水8 μL、探針+引物1 μL 和 DNA 1 μL 加樣，每個樣品做3 個重復，反應條件：先50 ℃保持2 min；然后95 ℃預變性10 min；最后95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測[13]。

建立標準曲線，用含有目的片段的質粒pGEM-T Easy-pol 作為標準品，根據公式：拷貝數/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，算出質粒標準品拷貝數。將其稀釋為109拷貝/μL～100 拷貝/μL，作為模板進行實時熒光定量PCR，建立標準曲線[13-15], 方法如前。

1.8 特異度實驗

設定MHV、SV、PVM、Reo3、BCV 及DBT細胞陰性對照，檢測MHV實時熒光定量PCR檢測方法的特異度。

1.9 靈敏度實驗[13-15]

1.9.1 質粒標準品拷貝數梯度檢測 將質粒標準品以109～100 拷貝/μL 進行梯度稀釋，每個拷貝數梯度均做3 個復孔。所能檢測的最小拷貝數梯度的循環(huán)閾值(Ct)≤35，同時拷貝數≥10，以此條件檢測靈敏度。

1.9.2 MHV滴度梯度檢測 將感染滴度為5.625 lg TCID50/mL的MHV病毒液從原液到10-9進行滴度梯度檢測，同時設107～103拷貝/μL 質粒標準品，通過標準曲線來進行定量。按照方法判定標準，以能夠檢測的最小滴度梯度的陽性結果檢測敏感度。

1.10 重復性和穩(wěn)定性實驗

用建立的方法對105拷貝/μL、106拷貝/μL、107拷貝/μL 3 個不同陽性標準品分3 個不同時間進行檢測，每次檢測每個標準品各做3 個復孔。通過計算實驗間變異系數, 評價建立方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.11 實時熒光定量PCR 方法的應用

1.11.1 樣本處理 共取211只動物(表1)的298份組織樣本，研磨后PBS 懸浮，1 000 r/min 離心10 min，取上清除菌過濾后，取0.2 mL 作為模板提取核酸，反轉錄cDNA 進行檢測。

1.11.2 樣本檢測 用建立的方法檢測上述298份組織樣本，同時設107～103拷貝/μL標準品、MHV陽性對照和DBT 細胞陰性對照。

1.11.3 方法驗證 為驗證實時熒光定量PCR方法的可信度，采用實驗室之前建立的MHV RT-PCR方法對79 只清潔級小鼠肝組織樣本進行檢測[8]。

1.12 結果判定標準

建立的標準曲線參數斜率為-3～-3.5、R2>0.99、Eff%為90%～110%，實驗成立可用于定量檢測[13-15]。

樣品Ct ≤35，同時拷貝數≥10, 判定該樣品檢測結果為陽性；Ct ≥35、拷貝數＜10，或者Ct ＜35、拷貝數≥10，或者Ct ＜35、拷貝數＜10，此樣品超出檢測限，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結果判為陰性[13-15]。

2 結果

2.1 標準曲線的構建

設1.0×101拷貝/μL～1.0×109拷貝/μL 含有目的片段的質粒標準品，作為模板進行實時熒光定量PCR，擴增曲線如圖1。從圖1 可以看出擴增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍1 個log(1×102拷貝～1×109拷貝)，標準曲線斜率為3.452(在-3～-3.5)，相關系數R2值為0.995(>0.99)，擴增效率Eff 為94.848%(90%～110%)，均符合標準曲線參數要求。標準品及待測樣本3 個重復的標準差(Ct SD 值)均小于0.461。說明構建的標準曲線相關性高，定量結果有效。

2.2 特異度檢測

特異度檢測結果顯示(圖2)，以SV、PVM、Reo3、BCV 為模板，擴增曲線均為直線無擴增，陰性對照小鼠星形膠質瘤細胞(DBT)細胞也為直線無擴增。而以MHV 為模板，擴增曲線明顯，檢測Ct 值為17.409，拷貝數為7.59×105拷貝/μL。說明建立的方法特異性良好。

圖1 109～101 拷貝標準品標準曲線Figure 1 The standard curve of 109-101 copies standard

圖2 MHV Q-PCR 特異性檢測結果Figure 2 The specific test results of MHV Q-PCR

2.3 重復性和穩(wěn)定性

起始濃度分別為1×106拷貝/μL、1×105拷貝/μL、1×104拷貝/μL 標準品的最終實測值均值分別為1.012×106、0.984×105、0.997×104拷貝/μL，對應Ct SD 值及變異系數(CV)值分別見表3。3 個梯度3 次重復實驗Ct 值的CV均小于5%，表明方法重復性和穩(wěn)定性均良好。

2.4 敏感度檢測

2.4.1 質粒標準品檢測 通過標準曲線(圖3)和擴增曲線(圖4)可以看出, 1×101～1×109拷貝/μL標準品各稀釋梯度間距均勻，線性范圍良好。斜率為-3.546，相關系數R2為0.996(>0.99)，擴增效率Eff%為91.433%(90%～110%)，均符合標準曲線參數要求。標準品稀釋到10 拷貝/μL時擴增曲線Ct 值為34.358，拷貝數為11.57 拷貝/μL，仍在判斷標準陽性樣本可信范圍之內，因此該方法的敏感度為10 拷貝/μL。

2.4.2 MHV濃度梯度檢測 標準曲線(圖5)及敏感性(圖6)檢測結果顯示，在107～103拷貝標準品標準曲線參數(斜率：-3.387，R2：0.999，Eff%：97.37%)符合要求的條件下，能夠檢測到陽性結果MHV 病毒液最小的梯度為10-5，其Ct 值為32.953，拷貝數為25.096 拷貝/μL，對應的MHV病毒滴度為1.625 lg TCID50/mL。

表3 熒光定量PCR 檢測方法的重復性和穩(wěn)定性Table 3 The repeatability and stability of fluorescence quantitative PCR method

圖3 109～101 拷貝標準品的標準曲線Figure 3 The standard curve of 109-101 copies standard

圖4 109～101 拷貝標準品擴增曲線圖Figure 4 The amplification curve of 109-101 copies standard

2.5 應用

2.5.1 樣本檢測結果 63 只裸鼴鼠肝、腦組織樣本、35 只SPF 小鼠、10 只長爪沙鼠、20 只倉鼠肝組織樣本和4 只黃鼠肝、脾、腦、心、肺、腎、盲腸內容物樣本的循環(huán)域值(Ct 值均＞35 和拷貝數均＜10)均在檢測限之外，所以判定上述樣本為熒光定量檢測結果陰性。以63份裸鼴鼠肝組織樣本和28份黃鼠組織樣本為例的檢測擴增曲線分別見圖7 和圖8。

79份清潔級小鼠肝組織樣本中有61份樣本按判定標準判定結果為陰性。有18 份樣本Ct 值(均＜35)和拷貝數(均＞10)均在檢測限之內，檢測結果判定為陽性。以前3 3 份清潔級小鼠樣本(CM1～CM33)為例，檢測擴增曲線見圖9，相應的標準品擴增曲線見圖10。陽性清潔級小鼠組織樣本檢測結果見表4。

圖5 107～103 拷貝標準品標準曲線Figure 5 The standard curve of 107-103 copies standard

圖6 MHV 敏感性檢測結果Figure 6 The sensibility test results of MHV

圖7 63 份裸鼴鼠肝組織檢測結果Figure 7 The testing results of 63 liver tissues of naked mole-rats

圖8 28 份黃鼠組織樣本檢測結果Figure 8 The test results of 28 tissue samples of ground squirrels

圖9 33 份清潔級小鼠肝組織(CM1～CM33)擴增曲線圖Figure 9 The amplification curve of 33 (CM1-CM33) liver samples of clean mice

圖10 107～103 拷貝標準品擴增曲線圖Figure 10 The amplification curve of 107-103 copies standard

2.5.2 方法的驗證 RT-PCR 檢測結果顯示，79份清潔級小鼠肝組織樣本中有16 份樣本(編號：C M 1、C M 3、C M 5、C M 7、C M 8、C M 9、CM10、CM12、CM14、CM15、CM17、CM18、CM19、CM30、CM31、CM32)可見目的條帶(約264 bp)。陽性擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果與GenBank中MHV核苷酸序列進行比對，其同源性均在91%以上。其他樣本均無目的條帶產生，結果均為陰性。

RT-PCR 方法檢測79 份清潔級小鼠肝組織MHV 核酸陽性率為20.25%(16/79)。與實時熒光定量PCR 方法檢測結果的符合率為97.47%(77/79)。以CM1～CM21 號和CM22～CM42 號樣本為例，電泳結果分別見圖11～12。

表4 陽性清潔級小鼠樣本檢測結果Table 4 The testing results of positive samples from clean grade mice

3 討論

裸鼴鼠作為嚙齒類動物，體格大小與小鼠相近，其基因組有93%的區(qū)域與人類、小鼠、大鼠保持較好的共線性關系[17]。同時其具有壽命長等天然獨特的生物學特性，因此越來越多地被用于人類生命科學的研究。但裸鼴鼠在課題項目啟動之前還沒有實驗動物化，沒有相應的微生物、寄生蟲等質量控制標準，因此裸鼴鼠的使用無法正規(guī)化和合法化，亟需制定裸鼴鼠微生物、寄生蟲等質量控制標準。MHV 不但是小鼠易感病原,同時也是沙鼠易感病毒之一[8,18], 而裸鼴鼠是與小鼠體型較近的嚙齒類動物，因此，制定裸鼴鼠微生物質量控制標準時，MHV是首先考慮要篩查和排除的病毒之一。目前國內外還沒有關于裸鼴鼠是否感染MHV 的相關檢測報道。因此本文選擇具有操作簡便、敏感、特異等優(yōu)點的熒光定量PCR 方法對裸鼴鼠攜帶MHV 的本底進行篩查。

圖11 CM1～CM21 號肝組織樣本RT-PCR 檢測結果Figure 11 The electrophoresis results of RT-PCR to detect CM1-CM21 liver samples

圖12 CM22～CM42 號肝組織樣本RT-PCR 檢測結果Figure 12 The electrophoresis results of RT-PCR to detect CM22-CM42 liver samples

用建立的方法對63 只裸鼴鼠進行檢測，結果均為陰性結果也均為陰性。分析原因：1)裸鼴鼠本身具有抗病毒的特點[19]，可能確實不感染MHV；2)實驗檢測的裸鼴鼠是經過屏障環(huán)境飼養(yǎng)的裸鼴鼠，由于環(huán)境、飼養(yǎng)條件等的改善，降低了被感染的概率。至于裸鼴鼠是否會感染MHV，有待進一步研究。

用建立的方法對10只清潔級沙鼠、20只SPF倉鼠及4 只屏障環(huán)境飼養(yǎng)的黃鼠檢測MHV 基因拷貝數，結果均為陰性，說明檢測的動物確實不存在MHV 感染。用實驗建立的方法對國內7 個單位送檢的35 只SPF 小鼠進行檢測，檢測結果均為陰性。

用建立的方法檢測國內送檢的79只清潔級小鼠(均為ELISA 方法檢測MHV 抗體陽性鼠群小鼠)，MHV 抗體陽性率為26.58%(21/79)，MHV核酸陽性率為22.78%。通過同時采用抗原和抗體進行檢測發(fā)現，抗體陽性的小鼠或鼠群抗原檢測可能為陰性，抗原陽性的小鼠或鼠群抗體檢測可能為陰性， 進一步說明在動物體內確實存在抗原抗體的差異性[8,20]。二者同時進行檢測彌補了漏檢的可能，對鼠群的質量控制會更加有效。

上述79只清潔級小鼠在用實驗建立的定時熒光定量PCR 檢測方法檢測的同時，采用實驗室比較成熟的RT-PCR 進行檢測[8]，核酸陽性率為20.25%(16/79)，二者符合率97.47%。雖然文獻有MHV 核酸檢測方法的報道[20-21]，但由于方法沒有進行推廣應用，市場上亦沒有我國自主研發(fā)的商品化MHV 熒光定量檢測試劑盒，因此實驗室在建立常規(guī)RT-PCR 方法的同時建立了MHV 熒光定量PCR 方法[8]，為試劑盒的研制奠定了基礎。

MHV 不僅是《實驗動物 國家標準》中對清潔級小鼠和SPF 小鼠要求必須排除項目，而且在沙鼠地方標準、《中國藥典》和WHO 乙型腦炎病毒減毒活疫苗制檢規(guī)程中對用于疫苗生產用倉鼠均是必須排除項目[22-28]。建立的MHV 檢測方法不僅可以用于裸鼴鼠病毒感染的篩查，亦可用于小鼠、沙鼠、倉鼠等嚙齒類實驗動物的檢測。