馬瑞欣 李同慶 張志華

摘要：建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-MS/MS）檢測(cè)漁用配合飼料中左旋肉堿含量的方法。樣品用超純水超聲提取提取液稀釋后經(jīng) HILIC色譜柱分離以乙腈和乙酸銨（含0.15%甲酸）溶液為流動(dòng)相梯度洗脫三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式掃描外標(biāo)法定量。結(jié)果表明左旋肉堿在0.2～100 ng/mL范圍線性良好（r>0.999）;檢出限0.5 μg/kg定量限1.5 μg/kg。在20、50和100 mg/kg添加水平下回收率為75.2%～111%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.4%～9.9%（n=6）。該方法前處理簡(jiǎn)單、快速定性定量準(zhǔn)確適合于漁用配合飼料中左旋肉堿的準(zhǔn)確定性定量。

關(guān)鍵詞：親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;左旋肉堿;漁用配合飼料

左旋肉堿（L-carnitine）是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類(lèi)氨基酸廣泛分布于自然界是生物體的基本成分其中肉類(lèi)和乳制品中左旋肉堿的含量最高而蔬菜和水果類(lèi)左旋肉堿的含量最低[1-2]。水產(chǎn)動(dòng)物自身能在肝臟和組織中合成左旋肉堿但在幼體時(shí)期體內(nèi)合成的肉堿遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足水產(chǎn)動(dòng)物快速生長(zhǎng)的需要此時(shí)其飼料中必須添加一定量的左旋肉堿[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外就左旋肉堿對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的研究表明：左旋肉堿能明顯提高魚(yú)類(lèi)增長(zhǎng)速度提高飼料蛋白質(zhì)的效率降低飼料系數(shù)提高魚(yú)肉品質(zhì)提高養(yǎng)殖成活率和繁殖率[3-5]。

文獻(xiàn)中有關(guān)左旋肉堿的檢測(cè)方法有很多[6]研究樣品多數(shù)為血漿[7-8]、乳制品[9-11]、尿液[12]、食品[1-2，13]、保健品[14-15]、減肥產(chǎn)品[16-17]等， 未見(jiàn)到有關(guān)飼料中左旋肉堿的檢測(cè)方法報(bào)道。筆者建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-MS/MS）檢測(cè)漁用配合飼料中左旋肉堿含量的方法該方法通過(guò)液相色譜柱分離質(zhì)譜選擇離子的方法進(jìn)行定性和定量減少了干擾可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)漁用配合飼料中左旋肉堿的含量。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜（日本島津）;QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX ）;十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯CPA225D）;千分之一電子天平（賽多利斯CP323S）渦旋振蕩器（IKAMS3-digital）;高速離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公HC-3518）;中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特FW135）。

左旋肉堿對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司純度≥98%）;實(shí)驗(yàn)所用超純水由Milli-Q超純水機(jī)制備;正己烷（色譜純Honeywell）。

一次性針式濾器（Pall25 mm0.22 μm）。

1.2實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件色譜柱GOLDHILIC（50 mm×2.1 mm×1.9 umThermoscientific公司 ）流動(dòng)相5 mmol/L乙酸銨（含V/V 0.15%甲酸）（A）和乙腈（B）;梯度洗脫：0～1 min 98% B; 1 min～3 min 98% B～10% B;3 min～3.1 min 10% B～98% B;3.1～6 min 98% B。流速0.5 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積2 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件電離模式：ESI+多反應(yīng)離子檢測(cè)（MRM）模式;噴霧電壓5 500 V;氣簾氣40 PSi; 碰撞氣Medium;離子源溫度550 ℃;霧化氣（GS1）55 PSi; 輔助加熱氣（GS2）55 PSi;去簇電壓60 V;碰撞池出口電壓（CXP）6.0 V。左旋肉堿母離子為m/z 162.0;定性離子對(duì)為m/z 162.0>85.0碰撞能26 eV;定量離子對(duì)為m/z 162.0>103.0碰撞能22 eV。

1.3樣品前處理

飼料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后稱(chēng)取1.000 g于50 mL離心試管中加入10 mL超純水渦旋振蕩2 min超聲提取20 min4 000 r/min離心10 min ，上清液倒入25 mL比色管中;再加入10 mL超純水重復(fù)提取一次合并上清液用超純水定容至25 mL。取3 mL上清液于10 mL離心試管中加入3 mL正己烷渦旋30 s10 000 r/min離心10 min去掉上層正己烷層取下層清液過(guò)0.22 μm濾膜后用超純水稀釋200倍供上機(jī)測(cè)試。

2結(jié)果與討論

2.1色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察了左旋肉堿在Hypersil gold C18Accucore aQ， ZORBAX RX-C8和Kinetex F5Hypersil GOLD HILIC色譜柱上的保留和分離能力。結(jié)果表明左旋肉堿在Hypersil gold C18Accucore aQ和ZORBAX RX-C8上不保留在死時(shí)間出峰。在Kinetex F5上保留較差出峰時(shí)間0.94 min且峰形極差;在Hypersil GOLD HILIC色譜柱上能夠得到峰形尖銳的色譜峰。這是因?yàn)樽笮鈮A為小分子極性化合物在弱極性C18和 C8填料的反相色譜柱上不保留。親水作用色譜（HILIC）采用極性固定相有機(jī)溶劑-水相緩沖液為流動(dòng)相能有效地保留反相色譜中保留不完全或不保留的強(qiáng)極性樣品并具有良好的分離效果[18]。

2.2流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇和水、乙腈和水、乙腈和乙酸銨溶液（含V/V0.15%甲酸）作為流動(dòng)相時(shí)左旋肉堿在Hypersil GOLD HILIC色譜柱的洗脫分離情況。結(jié)果表明：使用甲醇和水作為流動(dòng)相洗脫時(shí)保留時(shí)間0.27 min峰形擴(kuò)散嚴(yán)重響應(yīng)很低;使用乙腈和和水作為流動(dòng)相洗脫時(shí)保留時(shí)間合理但峰形拖尾嚴(yán)重;使用乙腈和乙酸銨（含V/V0.15%甲酸）溶液作為流動(dòng)相洗脫時(shí)峰形尖銳響應(yīng)明顯提高對(duì)稱(chēng)性增強(qiáng)。這是由于對(duì)HILIC色譜甲醇的洗脫能力強(qiáng)于乙腈且甲醇增加了分離的不確定性和較差的峰形[18]。因此在HILIC中一般采用乙腈-水作為流動(dòng)相。水相中加入一定比例的乙酸銨和甲酸可以提高離子化效率改善峰形。故選用乙腈和乙酸銨（含V/V0.15%甲酸）溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。標(biāo)準(zhǔn)溶液的HILIC-MS/MS譜圖見(jiàn)圖1。

2.3質(zhì)譜條件的確定

將1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵注入質(zhì)譜儀通過(guò)優(yōu)化去簇電壓、碰撞能等參數(shù)確定定性離子對(duì)為m/z 162.0>85.0和m/z 162.0>103.0m/z 162.0>103.0為定量離子對(duì)。

2.4樣品前處理?xiàng)l件的確定

左旋肉堿易溶于水所以本實(shí)驗(yàn)中采用水作為提取劑。考察水、0.2 mol/L鹽酸溶液、0.2%乙酸溶液的提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)試結(jié)果無(wú)差別所以采用超純水作為提取劑直接提取。

由于左旋肉堿廣泛分布于自然界是生物體的基本成分。它在植物性飼料干物質(zhì)中的含量要低于其在動(dòng)物性飼料中的含量但都在幾～幾百mg/kg數(shù)量級(jí)范圍[4]。由于質(zhì)譜的靈敏度高為防止對(duì)質(zhì)譜造成污染同時(shí)為降低基質(zhì)效應(yīng)和保證測(cè)試液落在線性范圍內(nèi)對(duì)提取液進(jìn)行了200倍稀釋后上機(jī)測(cè)試。

2.5基質(zhì)效應(yīng)

本方法為外標(biāo)法采用了稀釋和減小進(jìn)樣量的方法來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)。由于左旋肉堿天然存在無(wú)法獲得飼料空白樣品。本文取適量已知含量的稀釋前提取液添加一定量（體積盡可能?。┑臉?biāo)準(zhǔn)溶液和適量超純水使得最終得到的溶液中提取液稀釋200倍且添加濃度和原濃度保持基本相當(dāng)。通過(guò)上機(jī)測(cè)試由標(biāo)準(zhǔn)曲線給出提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液前后左旋肉堿的含量。通過(guò)比較添加標(biāo)準(zhǔn)溶液前后左旋肉堿的含量變化來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中利用三種飼料考察了基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1。基質(zhì)效應(yīng)=1-[ρ2/（ρ0+ρ1）] ×100%?；|(zhì)抑制呈現(xiàn)鱉飼料>鯽魚(yú)飼料>錦鯉飼料的現(xiàn)象與飼料中動(dòng)物源性成分的含量一致。由于基質(zhì)抑制<20%且回收率>75%見(jiàn)表2故本測(cè)定方法忽略基質(zhì)效應(yīng)。

2.6標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用十萬(wàn)分之一的電子天平稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并定容配制成100 μg/mL的儲(chǔ)備液用超純水逐級(jí)稀釋成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列按濃度由低到高進(jìn)LC-MS/MS測(cè)試以左旋肉堿定量離子對(duì)m/z 162.0>103.0的峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x做標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程y=6.469 26 x 104x+35 475.1相關(guān)系數(shù)r=0.999 73。根據(jù)鱉飼料、鯽魚(yú)飼料和錦鯉飼料中左旋肉堿的信噪比得出檢出限為0.5 μg/kg定量限為1.5 μg/kg。由于不同試樣中所含的左旋肉堿含量水平有差異如果測(cè)定結(jié)果超出了本方法的線性范圍需對(duì)樣品溶液稀釋后再測(cè)定。

2.7精密度和回收率

稱(chēng)取鱉飼料、鯽魚(yú)飼料、錦鯉飼料三種飼料樣品各12份6份做本底6份做標(biāo)準(zhǔn)溶液添加。按照本文建立的方法進(jìn)行前處理和測(cè)定考查方法的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8實(shí)際樣品的測(cè)定

用本文建立的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)客戶的6份樣品進(jìn)行測(cè)定測(cè)定值分別為562、51、168、360、466、288 mg/kg與客戶預(yù)期值一致。實(shí)際樣品的色譜圖見(jiàn)圖2。3結(jié)論

本研究建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定漁用配合飼料中左旋肉堿的分析方法。該方法前處理簡(jiǎn)單精密度高、定性定量準(zhǔn)確適合于漁用配合飼料中左旋肉堿的準(zhǔn)確定性定量。

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Abstract：An analytical method was developed for the determination of L-carnitine in fish formula feed by using hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry （HILIC-MS/MS）. The samples were extracted with ultrapure water by ultrasonic. The separation of L-carnitine was carried out on a Hypersil GOLD HILIC column using ammonium acetate （0.15% formic acid） and acetonitrile as mobile phases. The quantification analysis of the target compound was performed? under multiple reaction monitoring （MRM） mode by external standard method. A good linear relationship was obtained between the peak area and concentration of L-carnitine? in the range of 0.2～100 ng/mL with the correlation coefficient more than 0.999. The limit of detection （LOD）was 0.5 μg/kg and the limit of? quantification （LOQ）? was 1.5 μg/kg.? At spiked levels of 20，50 and 100 mg/kg， the? recoveries ranged from 75.2% to 111%， and the relative standard deviation ranged from 3.4% to 9.9%.The sample preparation was simple and rapid， and the results? were accurate. The developed? method is suitable for the determination of L-carnitine in in fish formula feed.

Key words：hydrophilic liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HILIC-MS/MS）; L-carnitine; fish formula feed

（收稿日期：2020-04-26）