郭書棟 李彤 米睿 鄭偉鋒 胡曉旻 齊振昌 宋元申 王成蕊

1天津醫(yī)科大學三中心臨床學院（天津300170）；2天津市第三中心醫(yī)院心外科（天津300170）；3天津市人工細胞重點實驗室，衛(wèi)生部人工細胞工程技術研究中心（天津300170）

離體心臟灌注技術是指將實驗動物心臟離體后，連接到特定的體外灌流裝置，以血液或灌流液灌注心臟，進行心臟體外研究的實驗技術［1］。目前常用的離體心臟灌注模式有Langendorff 和Working heart 兩種［2-3］。因為排除了神經(jīng)體液干擾，具有較好的穩(wěn)定性和可重復性等優(yōu)點，離體心臟灌注技術在心血管生理、生化及藥理等研究領域得到了廣泛應用［4-8］。然而，傳統(tǒng)的心臟離體手術中存在一些不可避免的局限性［9-11］：心臟離體過程中存在缺氧、停止灌注；修剪、排空心臟過程中的停跳和機械損傷；恢復灌注后缺血-再灌注損傷及心律失常等。為了彌補傳統(tǒng)心臟離體灌注技術的不足，本實驗探索了一種新的心臟離體灌注技術，避免了大鼠心臟離體過程缺血、缺氧、停跳，缺血再灌注等損傷，克服了再灌注后心律失常等局限性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠20 只，雄性，體質(zhì)量300～350 g，由中國食品藥品檢定研究院（大興）提供［SCXK（京）2017-0005］，本研究在實驗動物飼養(yǎng)和實驗過程中完全做到按實驗動物使用“減少、替代和優(yōu)化”3R 原則給予人道的關懷，并經(jīng)天津醫(yī)科大學三中心臨床學院醫(yī)學倫理委員會批準實驗。

1.1.2 設備及試劑離體心臟灌流系統(tǒng)（中國普升科技有限公司，Radnoti）、PH 儀（中國上海儀電科學儀器股份有限公司，PHS-3C）、多導聯(lián)生理記錄儀（美國Biopac MP150）、小動物呼吸機（美國Kent Scientific 公司，TOPO）、小動物外科器械包、肝素鈉（森諾生物科技有限公司）、余分析純試劑均購于天津福成化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Krebs-Henseleit液（K-H液）配置配置K-H液，以1 L為例：氯化鈉6.924 g、碳酸氫鈉2.080 g、氯化鉀0.350 g、磷酸二氫鉀0.163 g、葡萄糖1.800 g、硫酸鎂0.144 g、二水氯化鈣0.265 g，將前6 種分析純試劑依次溶于常溫去離子水，二水氯化鈣單獨溶解后緩慢倒入，充分攪拌至完全溶解，定容至1 L；K-H 液pH 7.3～7.4，所有K-H 液配置完成后均進行過濾。

1.2.2 分組及離體心臟灌注模型制備應用隨機數(shù)字表法將20 只SD 大鼠隨機分為兩組：傳統(tǒng)離體心臟灌注技術組（T 組，n= 10）和改進離體心臟灌注技術組（M 組，n=10）。

1.2.2.1 傳統(tǒng)離體心臟灌注技術組（T 組）及操作步驟（1）禁食12 h；（2）稱重；（3）全身肝素化：以200 IU/100 g 劑量肝素于術前1 h 腹腔注射；（4）麻醉：以3%的戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）進行腹腔注射；（5）固定；（6）快速開胸，暴露心臟；（7）游離心臟：提起心臟根部，剪斷心臟遠端血管，盡量保留較長的主動脈；（8）心臟排血與修剪，將心臟放到含有4 ℃的生理鹽水平皿中按壓心臟，擠出心腔中殘余血液，修剪主動脈，方便掛機灌注；（9）心臟掛機灌注，灌注針插入主動脈不宜過深，以免插入左室，影響心臟灌注；從開胸到心臟離體灌注保持在90 s 以內(nèi)完成。

1.2.2.2 改進離體心臟灌注技術組（M 組）及操作步驟（1）禁食12 h；（2）稱重；（3）麻醉：以3%的戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）進行腹腔注射；（4）固定、脫毛、消毒。（5）頸部切開，氣管插管；（6）開胸和心臟暴露；（7）游離胸腺；（8）游離右側(cè)頸動脈；（9）游離主肺間隔；（10）頸動脈插管；（11）經(jīng)頸動脈K-H 液預交換：用醫(yī)用延長導管將頸動脈灌注針頭和Radnoti 灌注系統(tǒng)連接，連接前注意全程管路預充K-H 液排氣。剪破下腔靜脈與右側(cè)上腔靜脈，剪破左心耳，打開動脈夾，開始經(jīng)頸動脈灌注心臟，待心臟跳動5 s 后，夾閉主動脈，再持續(xù)灌注2 min，使心臟血液交換為K-H 液；（12）心臟游離；（13）頸動脈-主動脈交換灌注：關閉頸動脈灌注通道，交換至主動脈灌注（圖1）。

1.2.2.3 灌注策略兩組均采用Radnoti 離體心臟灌注系統(tǒng)灌注，維持以下恒定狀態(tài)：恒溫：（37 ±0.5）℃，恒壓：（65 ± 5）mmHg；以95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)對K-H 液進行鼓泡式氧合。

1.2.3 心臟復蘇及存活時間記錄以K-H 液灌注開始為時間零點，分別記錄兩組（1）離體心臟灌注-復跳時間：灌注開始到心臟第一次起跳的時間；（2）復跳-穩(wěn)定跳動時間：心臟復跳到第1 次1 min內(nèi)無心律失常的時間；（3）存活時間：心臟灌注復跳開始到心臟停跳時間。

1.2.4 冠脈流量測定兩組均在以下時點測量：開始灌注后1、5、10、15、30 min、1、2 h 時1 min 內(nèi)的冠脈流量。

圖1 改進離體心臟灌注技術手術流程圖Fig.1 The modified surgical procedure diagram of isolated cardiac perfusion technique

1.2.5 心率與心律失常評分兩組開胸前均記錄基礎心率，改進組在心臟未離體前以3 個電極分別接到大鼠的右上肢，左下肢，右下肢記錄心電，心臟離體后兩組均以接觸式電極貼于心尖部，以Biopac MP150 多導聯(lián)生理記錄儀持續(xù)記錄心電圖參數(shù)。心律失常評判參考Curis-Walker Score E 評分標準［12］：（1）0 分：＜20 次室性早搏（VPB）；（2）1分：21 ～100次VPB；（3）2分：＞100次VPB和/（或）1 ～3 次室性心動過速（VT）；（4）3 分：＞3 次VT；（5）4 分：可自發(fā)轉(zhuǎn)為竇律的室顫（SVF）；（6）5 分：1 ～2 次不可轉(zhuǎn)為竇律的室顫（NVF）；（7）6 分：3 ～5 次NVF；（8）7 分：＞5 次NVF，對兩組2 h 內(nèi)心律失常發(fā)生進行評分。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，生存及復跳時間以中位數(shù)表示，組間比較采用兩組獨立樣本秩和檢驗；符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以（>）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組離體心臟灌注-復跳及復跳-穩(wěn)定跳動情況離體心臟經(jīng)過缺血再灌注會導致心律失常，觀察結(jié)果顯示：傳統(tǒng)組離體心臟最長灌注-復跳時間5 s，最短灌注-復跳時間2 s，灌注-復跳中位時間3 s；傳統(tǒng)組離體心臟最長復跳-穩(wěn)定跳動時間8.8 min，最短復跳-穩(wěn)定跳動時間4.2 min，復跳-穩(wěn)定跳動中位時間5.05 min；改進組離體心臟持續(xù)穩(wěn)定跳動，不存在停止灌注情況，不存在心律失常情況，與傳統(tǒng)組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），離體后更好的保持了心臟功能的穩(wěn)定（表1）。

表1 兩組離體心臟灌注-復跳時間，復跳-穩(wěn)定跳動時間情況Tab.1 Heart Perfusion-Rebeat time and Rebeat-Steady beat time of two groups

2.2 兩組離體心臟存活時間心臟離體后生理功能會持續(xù)惡化，導致心臟生存時間有限。實驗結(jié)果表明：改進組離體心臟存活時間（8.55 h）顯著長于傳統(tǒng)組（5.2 h）（P＜0.001）；相比于傳統(tǒng)的心臟分離方式，改進組對心臟功能保護和心臟生理狀態(tài)維持更具有優(yōu)勢，使離體狀態(tài)下心臟存活更長時間（圖2、表2）。

2.3 兩組冠脈流量比較離體心臟心肌代謝水平和冠脈流量密切相關，同時也反應了冠脈通暢水平。實驗結(jié)果顯示：傳統(tǒng)組離體心臟灌注后1 min內(nèi)冠脈流量為（5.17±0.94）mL/min，改進組為（9.59±0.80）mL/min，兩組灌注后1 min 內(nèi)冠脈流量差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。灌注開始前，傳統(tǒng)組心臟處于缺血、缺氧、低溫的應激狀態(tài)，本實驗觀察到傳統(tǒng)組離體心臟在灌注剛開始時，生理和代謝狀態(tài)仍處于較低的水平，表現(xiàn)為初始冠脈流量低于正常值；相比于改進組，離體心臟經(jīng)過缺血、缺氧、低溫的打擊后，冠脈流量在30 min、1、2 h 時出現(xiàn)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并隨著時間增加冠脈流量進一步下降（圖3、表3）。

圖2 兩組心臟存活時間比較Fig.2 Comparation of the survival time between the two groups

表2 兩組心臟存活時間Tab.2 Heart survival time of two groups h

圖3 兩組冠脈流量隨時間變化情況Fig.3 Changes of coronary flow with time in the two groups

表3 兩組不同時點冠脈流量情況Tab.3 Coronary flow at different time points in the two groups ±s>

表3 兩組不同時點冠脈流量情況Tab.3 Coronary flow at different time points in the two groups ±s>

注：與傳統(tǒng)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.001

冠脈流量（mL/min）傳統(tǒng)組改進組P 值1 min 5.17±0.94 9.59±0.80**＜0.001 5 min 9.61±0.81 9.64±0.86 0.834 10 min 9.21±0.82 9.65±0.77 0.097 15 min 9.18±0.83 9.61±0.79 0.080 30 min 8.76±0.85 9.56±0.83*0.047 1 h 7.99±0.67 9.36±0.78**＜0.001 2 h 7.14±0.80 9.10±0.76**＜0.001

2.4 兩組心率情況兩組心臟在離體前基礎心率差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與傳統(tǒng)組相比，改進組離體心臟于再灌注1、5、10、15、30 min、1 h、2 h 時的心率顯著高于傳統(tǒng)組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），且心率差距隨著時間增加而增大（圖4、表4）。

2.5 兩組心律失常比較傳統(tǒng)組心臟離體方式不可避免的導致再灌注后心律失常，實驗結(jié)果表明：傳統(tǒng)組離體心臟在0 ～30 min 內(nèi)的心律失常評分為（2.5 ± 1.6）分，心律失常發(fā)作總時程為（153 ±48.7）s，心律失常發(fā)生率為100%，其中心律失常類型以室早、室速為主，發(fā)生率均為100%，而室顫發(fā)生率相對較低，僅為20%。隨著離體心臟跳動時間增加，更嚴重的心律失常類型和發(fā)生頻率也隨之增加；實驗結(jié)果表明0 ～2 h 總評分為（3.2±1.8）分，心律失常發(fā)作總時程為（349 ± 67.1）s，室顫發(fā)生率上升至40%。與傳統(tǒng)組相比，改進組組所有離體心臟全程均未有心律失常發(fā)生，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，表5、6）。

圖4 兩組心率隨時間變化情況（次/min）Fig.4 The changes of heart rate with time in the two group（BPM）

表4 兩組不同時間的心率情況Tab.4 Heart rate at different time in the two groups ±s>

表4 兩組不同時間的心率情況Tab.4 Heart rate at different time in the two groups ±s>

注：與傳統(tǒng)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.001

心率（次/min）傳統(tǒng)組改進組P 值基礎401.0±22.1 400.9±21.6 0.992 1 min 165.1±18.7 316.8±7.6**＜0.001 5 min 251.8±15.7 317.2±7.6**＜0.001 10 min 279.6±7.3 318.1±7.6**＜0.001 15 min 280.1±5.7 319.3±7.6**＜0.001 30 min 282.6±4.9 321.5±7.6**＜0.001 1 h 277.5±6.6 320.6±7.6**＜0.001 2 h 272.1±6.1 320.4±7.7**＜0.001

表5 兩組0 ～30 min 心律失常評分比較Tab.5 Comparison of Arrhythmia score between two groups at 0 ～30 min

表6 兩組0 ～2 h 心律失常評分比較Tab.6 Comparison of Arrhythmia score between two groups at 0 ～2 h

3 討論

Langendorff 提出的離體心臟灌注方法使心臟研究領域獲益100 余年，眾多研究者不斷對其進行改進并擴展應用于各類型哺乳實驗動物，如大鼠、小鼠、兔、狗、豬等［11-15］，使之成為了近現(xiàn)代心臟研究領域廣泛應用的模型。其中應用最為廣泛的離體心臟研究動物為大鼠，然而該模型所采用的心臟分離方法至今未有顯著改進，應用傳統(tǒng)的心臟分離方法不可避免的存在缺血、缺氧損傷，機械操作損傷及心律失常等問題，進而在一定程度上影響離體后心臟生理狀態(tài)和功能。

大量研究表明心臟經(jīng)過缺血再灌注會導致心律失常，其機制主要涉及鈣超載［16-18］和氧自由基增加［19-21］等，避免心臟離體過程中缺血再灌注可以有效的減少心律失常的發(fā)生。從改進組心律失常的觀測結(jié)果可以看出，未經(jīng)歷缺血再灌注的心臟在實驗全程中均未有心律失常出現(xiàn)，這與現(xiàn)有理論相一致。傳統(tǒng)方法分離的心臟需要等待10 ～20 min 作為心臟穩(wěn)定期，才能開始實驗，而改進組在心臟離體后就已經(jīng)處于穩(wěn)定跳動狀態(tài)，不需要等待穩(wěn)定，可以更快開展實驗。

相比于傳統(tǒng)組，改進組離體心臟未經(jīng)歷過缺血再灌注，缺氧，低溫，操作損傷的離體心臟，其心率，冠脈流量均顯著提高，其反應的就是改進組的離體心臟具有更好的生理狀態(tài)、更高的心肌活性，酶活性及代謝水平［22-25］，心臟功能得到了最大限度的保持，生理活性更接近在體時的心臟。

本研究創(chuàng)新地改變大鼠心臟離體的手術方式，通過頸動脈插管來實現(xiàn)持續(xù)灌注狀態(tài)下分離心臟，從根本上克服了傳統(tǒng)心臟分離方式的局限性，實現(xiàn)了大鼠離體心臟模灌注模型制備技術的重大突破。

本研究的改進心臟離體灌注方法的優(yōu)勢有：（1）心臟離體過程實現(xiàn)了持續(xù)灌注，全程無熱缺血，冷缺血，缺氧，擠壓心臟，停跳，缺血再灌注等問題。特別是對于離體心臟凋亡，自噬等研究具有重要意義。（2）復跳后心臟無心律失常，心臟功能和存活時間顯著高于經(jīng)典方法。該改進方法同時也存在局限性，如：實現(xiàn)離體心臟持續(xù)灌注對外科手術技術要求較高，該技術學習周期相對較長等缺點。本實驗團隊將在后續(xù)階段進行左室測壓、心肌酶、分子生物學、代謝組學等方面實驗，進一步完善該改進技術的優(yōu)勢論證，簡化手術操作。綜上所述，本實驗探索的改進大鼠心臟離體灌注技術可以為心臟生理學，藥理學等研究提供更合適的離體心臟模型，以此模型開展的心臟藥理學研究可以更好的指導臨床藥物應用，并且此種心臟分離方法可以廣泛應用于心臟移植中的供體獲取與保存，為將來無損心臟獲取和保存提供新手段。