盧敏 鄭相濤 毛華 沙衛(wèi)紅

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院消化內(nèi)科（廣州510282）；2南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510282）；3廣東省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（廣州510080）

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)腸癌是導(dǎo)致癌癥死亡的第四大原因［1］。結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良和導(dǎo)致高病死率的重要因素。BMI1基因在結(jié)直腸癌中高度表達(dá)［2］，且BMI1 參與癌細(xì)胞增殖、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而，通過生物信息學(xué)分析對(duì)結(jié)腸癌差異表達(dá)的BMI1 基因研究較少，且其參與結(jié)腸癌增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。本研究基于GEO 數(shù)據(jù)庫獲取結(jié)腸癌基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)結(jié)腸癌生存預(yù)后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找結(jié)腸癌治療的靶基因BMI1，并通過RNA 干擾技術(shù)檢測(cè)干擾靶基因后對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移力的影響及作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑胎牛血清（FBS，Hyclone），培養(yǎng)基（DMEM，Gibco），脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），transwell 小室（costar，美國），matrigel膠（BD，美國）。 SYBR RT PCR Kit 為TaKaRa 生物科技有限公司產(chǎn)品，BMI1、P16ink4a、E-cadherin、Vimentin 一抗均為美國Abcam 公司Santa cruz 公司產(chǎn)品。

1.2 生物信息學(xué)分析在GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE50760序列號(hào)相關(guān)的結(jié)直腸癌信息；收集了結(jié)直腸癌原發(fā)癌組織、轉(zhuǎn)移瘤組織以及正常組織各18 例。另外通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫收集結(jié)直腸癌相關(guān)的資料。（篩選條件：（1）cancer type：colorectal cancer；（2）gene：BMI1；（3）data type：mRNA 或DNA；（4）analysis type：cancer vs normal analysis）。利用R 軟件及相關(guān)軟件包對(duì)GSE50760 表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：|logFC|≥2，校正后P＜0.05。同時(shí)繪制差異表達(dá)基因熱圖及火山圖，分析BMI1 表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，當(dāng)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)LOVO 結(jié)腸癌細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)消化疾病研究所贈(zèng)送。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向敲除BMI1 mRNA（siBMI1）的三對(duì)siRNA 序列由蘇州吉瑪生物科技有限公司（中國上海）合成。將LOVO 細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種到24 孔板中，細(xì)胞密度為105個(gè)細(xì)胞/孔，每個(gè)孔添加不含抗生素的培養(yǎng)基500 μL，直到細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%～80%匯合。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)用熒光標(biāo)記的FAM-siRNA 評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol 從細(xì)胞中提取RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR（RT-qPCR）以檢測(cè)BMI1 mRNA 表達(dá)情況并篩選出具有最大抑制效率的siBMI1。使用SYBR?PremixEx Taq TM（Takara）試劑盒進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。本研究中使用的BMI1 基因的引物序列如下所示：有義鏈5′GCCAACAGCCCAGCAGGAGG3′，反義鏈：5′TTGGTGGTTACCGCTGGGGC3′。擴(kuò)增的長度為203 bp。PCR 循環(huán)為95 ℃30 s，39 個(gè)循環(huán)，95 ℃5 s 和60 ℃30 s。所有樣本重復(fù)3 次；將β-catenin 作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)水平。選取最有效的siRNA 序列用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將LOVO 細(xì)胞懸液分別接種在96 孔板中培養(yǎng)約24 h 后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別以特異性BMI1 的siRNA 序列（siBMI1組）和非特異性siRNA 序列（NC 組）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后培養(yǎng)48 h 后。每孔加入10μL CCK-8 溶液，然后在37 ℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后用分光光度計(jì)在450 nm 處讀取吸光度（OD值）。

1.7 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力使用transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOVO 細(xì)胞的侵襲性，將含有5 μL Matrigel 基底膜基質(zhì)的transwell 小室置于24孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為2組：siBMI1組和陰性對(duì)照（NC）組。轉(zhuǎn)染后在24 h 和48 h 收集細(xì)胞，并以5 × 105個(gè)細(xì)胞/mL 的密度接種到transwell室中下室中加入完全培養(yǎng)基。24 h 和48 h 后取出transwell 小室，將細(xì)胞染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。將細(xì)胞染成藍(lán)色，而聚碳酸酯膜孔顯示為黑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞周期變化結(jié)腸癌細(xì)胞也分為2 組：siBMI1 組和陰性對(duì)照（NC）組，轉(zhuǎn)染后在24 h 和48 h 收集細(xì)胞。然后用PBS 洗滌細(xì)胞兩次，用70%乙醇在冰上固定20 min，隨后用PBS洗滌3 次。然后，將細(xì)胞懸浮于含有0.2 mL RNase和0.5 mL PI 染色液的200 μL PBS 中，并在37 ℃下染色15 min，接著在流式細(xì)胞儀（FACSVerse；BD Biosciences，USA）上分析細(xì)胞。

1.9 Western Blot檢測(cè)從轉(zhuǎn)染siBMI1和scramble siRNA 轉(zhuǎn)染的LOVO 細(xì)胞中提取蛋白進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)變化。細(xì)胞離心后收集沉淀并在冷的細(xì)胞裂解緩沖液中裂解。在4 ℃下離心10 min后，通過12%SDS-PAGE 分離上清液并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與封閉溶液（5%脫脂乳；Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO）在室溫下培養(yǎng)1 h，然后與下列一抗在4 ℃培養(yǎng)一夜：兔抗人BMI1 抗體（Abcam 公司，美國），兔抗人P16ink4a 抗體，兔抗人E-鈣粘蛋白抗體，兔抗人Vimentin 抗體（Santa cruz，美國）。接下來，用含有Tween-20（1 mL/L）的1X tris 緩沖鹽水洗滌膜，并與二抗一起溫育。 使用ECL 系統(tǒng)檢測(cè)膜上的抗體-抗原復(fù)合物，并用Image Pro Plus 軟件定量蛋白質(zhì)條帶的相對(duì)強(qiáng)度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件（IBM，美國）和Graphpad prism 6.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。CCK-8細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)，Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌差異基因篩選使用GEO 數(shù)據(jù)庫對(duì)GSE50760 表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異基因，繪制結(jié)直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)基因熱圖（圖1）以及火山圖（圖2）。通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析，BMI1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量高于正常組織（P＜0.05，圖3）。

2.2 BMI1在結(jié)直腸癌和正常組織之間的表達(dá)差異及其與預(yù)后的分析通過分析數(shù)據(jù)集GSE50760 中18 例結(jié)直腸癌患者原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌及癌旁組織的BMI1 基因表達(dá)的豐度值，發(fā)現(xiàn)BMI1 在同一患者原發(fā)結(jié)直腸癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其癌旁組織，而在同一患者轉(zhuǎn)移癌組織的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于原發(fā)癌組織（P＜0.01，圖4）。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，BMI1 的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后之間存在相關(guān)性，高表達(dá)BMI1的患者總體病死率較高，低表達(dá)BMI1 的患者預(yù)后較好（P＜0.05，圖5）。

圖1 結(jié)直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)基因熱圖Fig.1 Thermogram of differentially expressed genes between colorectal cancer and normal tissue samples

圖2 結(jié)直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)基因的火山圖Fig.2 Volcanic map of differentially expressed genes between colorectal cancer and normal tissue samples

圖3 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中關(guān)于BMI1 在結(jié)直腸癌總的表達(dá)Fig.3 The expression of BMI1 in colorectal cancer in Oncomine database

圖4 BMI1 蛋白在結(jié)直腸癌原發(fā)癌組織、轉(zhuǎn)移瘤組織及正常組織中的表達(dá)Fig.4 The expression of BMI1 protein in primary cancer，metastasis of colorectal cancer and normal tissues

圖5 數(shù)據(jù)集GSE50760 中BMI1 表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后之間的生存曲線Fig.5 The survival curve between BMI1 expression and colorectal cancer prognosis in GSE50760

2.3 選擇最大抑制效率的siBMI1 序列首先通過RT-PCR 評(píng)估了3 種siBMI1 的效能，發(fā)現(xiàn)第一種siBMI1 在LOVO 細(xì)胞中具有最強(qiáng)的抑制效率（約80%）。該siBMI1 的上游引物序列為5′GGAUCGGAAAGUAAACAAATT3′，下游引物序列為5′UUUGUUUUUUUCCGAUCCTT3′，見圖6。

圖6 BMI1 基因干擾抑制結(jié)腸癌細(xì)胞mRNA 的表達(dá)Fig.6 BMI1 gene interference suppresses mRNA expression by siRNA in colorectal cancer cells

2.4 BMI1 敲除抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖通過CCK8測(cè)定細(xì)胞生長時(shí)間，BMI1 基因干擾后發(fā)現(xiàn)siBMI1顯著抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞增殖（圖7）。

圖7 BMI1 敲除抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖Fig.7 BMI1 knockout inhibits proliferation of colorectal cancer cells

2.5 BMI1 敲除抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移Transwell 小室遷移試驗(yàn)確定BMI1 敲除對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲力的影響。與NC 組相比，siBMI1 組的遷移明顯較弱（307±12.12vs.181.33±8.14，P＜0.05，圖8）。表明BMI1 敲除可以抑制結(jié)腸直腸癌LOVO細(xì)胞的侵襲。

圖8 BMI1 敲除抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移Fig.8 BMI1 knockout inhibits invasion and migration of colorectal cancer cells

2.6 BMI1 敲除抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)展進(jìn)一步通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMI1 敲除對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。BMI1 敲除后，促使結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期中G1 期的停滯和S 期的縮短，因此BMI1 敲除可通過抑制癌細(xì)胞細(xì)胞周期來抑制癌細(xì)胞增殖（圖9）。

2.7 BMI1 敲除上調(diào)P16ink4a 表達(dá)并抑制EMT表達(dá)siBMI1 組中的BMI1 蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染后48 h顯著低于NC組（P＜0.05）（圖10A、B）。降低的BMI1水平與siBMI1 組中P16ink4a 表達(dá)水平的增加相一致（P＜0.05）（圖10A、C）。進(jìn)一步檢測(cè)EMT 相關(guān)的E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)。如Western 印跡所示（圖10A、D、E），在SiBMI1 轉(zhuǎn)染后，E-鈣粘蛋白表達(dá)增加，但波形蛋白表達(dá)降低。這些研究表明，BMI1 的敲除可能通過抑制EMT，上調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)和下調(diào)波形蛋白的表達(dá)，從而抑制LOVO 細(xì)胞的侵襲。

3 討論

圖9 BMI1 敲除抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)展Fig.9 BMI1 knockout inhibits the progression of colorectal cancer cells cycle

圖10 BMI1 基因敲除對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中P16INK4a 及EMT 表達(dá)的調(diào)節(jié)Fig.10 Regulation of P16INK4a and EMT expression by BMI1 gene knockout in colorectal cancer cells

結(jié)腸直腸癌是消化道的常見惡性腫瘤。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2018年的最新報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌的病死率在全球排名第4 僅次于肺癌、乳腺癌和前列腺癌［3］。結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后最重要的因素。因此，需積極尋找結(jié)腸癌治療的新方法。

HAUPT 等［4］首先在小鼠淋巴瘤中鑒定出BMI1基因，并證明BMI1 是一種關(guān)鍵的多梳蛋白，參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖。同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMI1 和c-myc基因共同引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生［5］。BMI1 在許多惡性腫瘤中均有過表達(dá)，包括前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌和結(jié)腸癌［6-9］。在結(jié)直腸癌組織中，BMI1的表達(dá)水平顯著增加；并且與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)［9］。所有研究表明BMI1 是致癌基因，其沉默會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在本研究中，從GEO 數(shù)據(jù)庫下載結(jié)腸癌芯片數(shù)據(jù)GSE50760，分為癌組織和正常組織，利用GEO2R在線對(duì)其處理分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMI1 在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，且BMI1 的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后之間存在相關(guān)性。siRNA 可沉默轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染48 h 后可抑制靶基因的表達(dá)。有研究［10］表明，利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)干擾酰基輔酶A 一膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACATl）基因在人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞中的表達(dá)，可抑制人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力。在本研究中，用RNA 干擾技術(shù)將siBMI1 轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞，可有效抑制BMI1 的表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制癌細(xì)胞增殖遷移。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可促進(jìn)結(jié)腸癌等惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，有研究表明，BMI1 通過E-cadherin 的下調(diào)促進(jìn)了結(jié)腸CSCs 的侵襲和遷移，這可能是由于EMT 增加所致［11］。然而，結(jié)腸癌細(xì)胞中BMI1 和EMT 之間確切機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，可以通過miRNA 靶向敲除PTEN 和其他EMT 相關(guān)基因（例如Twist1，ZEB1 和BMI1）來激活或減弱EMT和CSC［12］。此外，P16ink4a通過miR-141/miR146b-5p 抑制EMT。但結(jié)腸癌細(xì)胞中BMI1 是否通過P16ink4a 促進(jìn)EMT 尚不清楚。

編碼自INK4a 基因的P16ink4a 可以滅活CDK，且與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)［12］，P16ink4a 抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白并使腫瘤細(xì)胞停止在G1/S期［14］。一些關(guān)于腫瘤進(jìn)展的研究表明，P16ink4a是BMI1 的下游基因，其表達(dá)被BMI1 抑制［15］。本研究發(fā)現(xiàn)BMI1 敲除不僅增加了P16ink4a 的表達(dá)，也使細(xì)胞停滯在G1期，從而阻礙了結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制細(xì)胞增殖，這與之前研究結(jié)論一致。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是涉及各種因素和多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的復(fù)雜過程。EMT 是結(jié)腸腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一種常見過程［16］。在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞失去其上皮特征，并在特定的生理和病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞。已有的研究表明EMT 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，且在EMT 過程中觀察到E-鈣粘蛋白水平降低，而波形蛋白和纖維連接蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物增加［17］。由此推測(cè)，其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是：E-鈣粘蛋白的減少導(dǎo)致細(xì)胞間粘附減少，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［18-19］。在進(jìn)一步的研究驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，BMI1 敲除增加了E-鈣粘蛋白的表達(dá)并減少了波形蛋白的表達(dá)，最后抑制EMT。結(jié)果表明BMI1 與E-鈣粘蛋白呈負(fù)相關(guān)，而與波形蛋白呈正相關(guān)，BMI1 基因敲除通過上調(diào)E-鈣粘蛋白抑制LOVO 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，BMI1 通過EMT 促進(jìn)腫瘤遷移和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，BMI1 介導(dǎo)Hes1 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移，下調(diào)PTEN 并激活A(yù)kt/GSK3β途徑，從而誘導(dǎo)EMT 和細(xì)胞骨架重建并導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)［20］。相應(yīng)地，BMI1 敲除通過PTEN/p-Akt/p-NFκB/MMP-2 途徑逆轉(zhuǎn)EMT 改變，顯著抑制黑色素瘤的侵襲行為［21］。筆者推測(cè)BMI1/PTEN/Akt/信號(hào)傳導(dǎo)與結(jié)腸癌進(jìn)展中的EMT 活化相關(guān)。此外，還有研究證明BMI1 在乳腺癌進(jìn)展期間調(diào)節(jié)P16ink4a和細(xì)胞周期蛋白D1 的表達(dá)［22］。更重要的是，已證明P16ink4a 通過miR-141/miR146b-5p 及其靶標(biāo)AUF1 抑制EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來控制衰老［23］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P16ink4a 與E-鈣粘蛋白呈正相關(guān)，與波形蛋白呈負(fù)相關(guān)。因此，筆者推測(cè)沉默BMI1可能通過上調(diào)P16ink4a 的表達(dá)來抑制EMT。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，BMI1 基因與結(jié)腸癌的增殖，侵襲和遷移密切相關(guān)，RNA 干擾可下調(diào)BMI1表達(dá)，抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能通過上調(diào)P16ink4a 的表達(dá)而抑制EMT 相關(guān)。但BMI1有無通過其他信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲和遷移，其具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。