劉朝林 徐通潔 黃寅 何虎強(qiáng) 施森 劉勇 何延政

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科（四川瀘州646000）

目前心血管疾病是全球死亡的首要原因［1］，而動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是常見的心血管疾病之一。AS 是由多種危險因素促進(jìn)的心血管疾病，包括巨噬細(xì)胞的積累，促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的功能障礙［2-4］。目前的研究認(rèn)為VSMCs 的增殖與AS 的修復(fù)有著密切聯(lián)系［6］。然而，目前關(guān)于AS 中VSMCs 的增殖和遷移的具體調(diào)控機(jī)制尚不完全明確［7］。因此，研究VSMCs 的增殖和遷移機(jī)制對AS 和血管成形術(shù)后再狹窄的治療和干預(yù)具有重大意義。

二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）是一種普遍表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白酶，又稱為腺苷 脫 氨酶絡(luò)合蛋白2 或T 細(xì)胞表面抗原CD26［8］。研究發(fā)現(xiàn)在多種組織中均表達(dá)DPP4，如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)DPP4 在心血管功能的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用［10］。例如，NINA-WRONKOWITZ 等［11］研究發(fā)現(xiàn)可溶性DPP4（sDPP4）通過蛋白酶活化受體2 誘導(dǎo)人類血管平 滑肌細(xì)胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs）的炎癥和增殖。ISHIBASHI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)sDPP4 通過6-磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子受體2 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。在筆者的前期實(shí)驗(yàn)研究中，也證實(shí)了DPP4 可以通過ERK/NF-κβ信號通路促進(jìn)HVSMCs 的鈣化［13］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是屬于非編碼RNA 家族中一類長度超過200個核苷酸且無蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 分子［14］。LncRNA 可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控［15］。研究表明，LncRNA 存在組織特異性、細(xì)胞特異性、發(fā)育階段特異性、時空特異性以及疾病特異性［16］。在筆者的同期研究中，發(fā)現(xiàn)DPP4 可以通過抑制LncRNA ENST00000540293 的表達(dá)，從而促進(jìn)HVSMCs 的鈣化［17］。而LncRNA ENST00000565307位于16號染色體，長度為593 個核苷酸，是基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的天然反義基因，其在HVSMCs 增殖和遷移過程中的作用和機(jī)制尚未明確。本研究以sDPP4 干預(yù)HVSMCs，驗(yàn)證DPP4 可促進(jìn)HVSMCs 增殖和遷移，并進(jìn)一步探究相關(guān)LncRNAs 在其過程中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料HVSMC、SMCM（Sciencell 公司，美國），sDPP4（R&D 公司，德國），MMP-2 抗體（abcam 公司，英國），羊抗鼠熒光二抗（DyLight 800）（Cell Signaling Technology 公司，美國），RNA 提取試劑盒（四川成都福際生物公司，中國），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO 公司，日本），LncRNA 引物和mRNA引物（武漢生工公司，中國）見表1，LncRNA 沉默試劑盒（廣東銳博公司，中國），PCR 試劑盒（QIAGEN 公司，荷蘭），CCK-8 試劑盒（東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，中國）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HVSMCs置于液氮中凍存，SMCM培養(yǎng)基遵循說明書配置，4 ℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)過程中嚴(yán)格遵循無菌操作原則，每2～3 d 換液一次，細(xì)胞生長融合大于95%時用0.25%胰酶（不含EDTA）消化傳代，使用第3 ～8 代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 基因芯片檢測HVSMCs 分為空白對照組和DPP4 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組，干預(yù)4 d 后，分別收集細(xì)胞，提取總RNA，測定RNA 的濃度及完整性，質(zhì)量檢測合格后，由上海康成生物公司進(jìn)行基因芯片技術(shù)篩查檢測上述兩組間差異表達(dá)的LncRNAs，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，選擇實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)升高明顯的基因LncRNAENST00000565307 作為后續(xù)研究目標(biāo)。

1.2.3 基因沉默根據(jù)LncRNA沉默試劑盒說明書，將細(xì)胞分為4組。以1×105個/孔的密度將HVSMCs 接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度大于50%時開始轉(zhuǎn)染。采用LncRNAENST00000565307 smart silencer 推薦沉默濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)以100 nmmol/L 作為后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)濃度。轉(zhuǎn)染步驟：在CP buffer（1×）中加入lncRNAENST00000565307 smart silencer，混勻，再加入CP reagent，混勻后室溫靜置15 min，最后加入各組培養(yǎng)基中。空白對照組僅加入SMCM 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染對照組加入含轉(zhuǎn)染試劑的SMCM 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染陰性組加入含lncRNAENST00000565307 沉默陰性對照試劑的SMCM 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染陽性組加入含lncRNAENST00000565307 沉默陽性對照試劑的SMCM 培養(yǎng)基。細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)48 h 后，采用RTPCR 檢測lncRNAENST00000565307 的沉默效果。

1.2.4 熒光定量PCR根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書，提取總RNA 并測定濃度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；LncRNA 引物和mRNA 引物均使用Primer Premier 5.0 設(shè)計，最終由武漢生工公司合成，引物序列見表1。以β-actin 作為內(nèi)參，參照PCR 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)（RT-qPCR）。反應(yīng)條件設(shè)定為：預(yù)變性（95 ℃，2 min），擴(kuò)增（95 ℃5 s、60 ℃10 s；45 個循環(huán)）；通過溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。最終結(jié)果用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)水平。每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)以1×105個/孔的密度將HVSMCs接種于6 孔板，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞密度大于60%時，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞24 h，200 μL 槍頭于6 孔板每孔中心細(xì)胞表面作一垂直水平線的劃痕，洗去劃痕上的細(xì)胞，分別加入預(yù)先配置好的培養(yǎng)基，分別于0、48 h 觀察細(xì)胞生長情況，測量劃痕寬度，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HVSMCs，以1 × 105個/孔的密度將HVSMCs 接種于Transwell 12 孔板上層小室，上層小室分別加入條件培養(yǎng)基，下層小室加入SMCM 培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。將Transwell 12 孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于48 h 后收集小室，多聚甲醛固定小室底部碳酸脂微孔膜上的細(xì)胞，用棉簽輕輕擦去上室未穿過孔的細(xì)胞，下室細(xì)胞用龍膽紫染色，顯微鏡下人工計數(shù)視野中遷移細(xì)胞數(shù)量，數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較。

1.2.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)收集干預(yù)后的HVSMCs，提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。SDSPAGE 分離后 轉(zhuǎn) 至PVDF 膜，用5% BSA 封閉液封閉，加入MMP-2（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后用TBST 洗膜3次，加入羊抗鼠熒光二抗（1∶50 000）室溫下孵育1 h，再用TBST 洗膜3 次，使用免疫熒光成像系統(tǒng)曝光，圖像分析軟件掃描條帶，用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算灰度值，計算MMP-2 的相對表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPP4 可以促進(jìn)HVSMCs 的增殖遷移與對照組相比，DPP4（200 ng/mL）干預(yù)HVSMCs 48 h后，其增殖能力明顯提高（P＜0.0001，圖1A）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明DPP4 促進(jìn)了HASMCs 的“創(chuàng)傷”愈合（圖1B、1C）。

2.2 基因芯片分析將HVSMCs分為空白對照組和DPP4誘導(dǎo)組，以200 ng/mL的DPP4濃度干預(yù)4 d，提取總RNA，進(jìn)行基因芯片篩查，部分差異表達(dá)的LncRNAs（圖2A），選取上調(diào)明顯的LncRNA ENST-00000565307，同時在http：//genome.ucsc.edu 中查找到LncRNAENST00000565307 是基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的天然反義基因。采用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證LncRNAENST00000565307 在空白對照組和DPP4誘導(dǎo)組的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，DPP4 誘導(dǎo)組中LncRNAENST00000565307 的表達(dá)顯著上升（P＜0.05，圖2B）；且MMP-2 蛋白的表達(dá)顯著上升（P＜0.001，圖2C、2D）。

圖1 DPP4 對人血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的影響Fig.1 Effect of DPP4 on proliferation and migration of human vascular smooth muscle cells

圖2 DPP4 對HVSMCs 的LncRNAs 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DPP4 on LncRNAs expression in HVSMCs

2.3 沉默LncRNA ENST00000565307 后MMP-2蛋白的表達(dá)下調(diào)以100 nmol/L 的LncRNA ENST-00000565307 smart silencer 濃度轉(zhuǎn)染HVSMCs 后，與轉(zhuǎn)染陰性試劑對照組相比，轉(zhuǎn)染陽性試劑組LncRNA ENST00000565307 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001，圖3A），同時MMP-2 蛋白在轉(zhuǎn)錄水平也明顯下調(diào)（P＜0.01，圖3A），免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明MMP-2蛋白的表達(dá)同樣明顯降低（P＜0.001，圖3B）。

2.4 沉默LncRNA ENST00000565307后HVSMCs的增殖遷移能力下降細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，與對照組相比，沉默組HVSMCs 的增殖能力顯著下降（P＜0.05，圖4B）；在劃痕實(shí)驗(yàn)中，與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染陽性組HVSMCs 的創(chuàng)傷愈合能力顯著下降（P＜0.05，圖4C、4D）；在Transwell實(shí)驗(yàn)中，與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比，沉默組HVSMCs 的遷移能力顯著下降（圖4A）。而與對照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照組的創(chuàng)傷愈合能力和遷移能力并沒有明顯的差異。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，好發(fā)于大中動脈，是常見的心血管疾病之一，也是全球發(fā)病率和死亡率最常見的疾病之一［18］。血管重塑與AS 的進(jìn)展密切相關(guān)，VSMC 的增殖和遷移是血管重塑中的主要細(xì)胞事件［19］。VSMC 的增殖和遷移在內(nèi)膜增生中起重要作用［20］。因此，探究VSMC增殖和遷移的相關(guān)機(jī)制對于治療或干預(yù)AS 和血管成形術(shù)后再狹窄具有重大意義。

圖3 LncRNA ENST00000565307 沉默后對蛋白MMP-2 的影響Fig.3 Effect of LncRNA ENST00000565307 on protein MMP-2 after silencing

圖4 沉默LncRNA ENST00000565307 后對HVSMCs 增殖遷移的影響Fig.4 Effect of silencing LncRNA ENST00000565307 on proliferation and migration of HVSMCs

研究表明，DPP4 抑制劑可以上調(diào)胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）等表達(dá)，從而起到保護(hù)心血管的作用，其作用機(jī)制和增加GLP-1 的生物利用度相關(guān)［21］，研究還發(fā)現(xiàn)DPP4可以通過蛋白酶活化受體2促進(jìn)HVSMCs的增殖［11］。本研究驗(yàn)證了DPP4 可以促進(jìn)HVSMCs 的增殖遷移，使用DPP4 干預(yù)HVSMCs 48 h 后，相比 對 照組，DPP4 干 預(yù)組HVSMCs 增 殖明顯增強(qiáng)，遷移能力增強(qiáng)，且MMP-2 的表達(dá)明顯上調(diào)。但是DPP4 促進(jìn)HVSMCs 增殖的相關(guān)分子機(jī)制尚未完全明確。

LncRNA 在許多生物過程中均發(fā)揮著調(diào)控的作用［22］。LncRNA LINC00341 通過miR-214/FOXO4反饋環(huán)促進(jìn)VSMCs增殖和遷移［23］。LncRNA XR007793 通過抑制miR-23b 調(diào)節(jié)VSMCs 的增殖和遷移［24］。本研究通過基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)在HVSMCs 的增殖遷移過程中，多種LncRNA 存在異常表達(dá)，且在DPP4 干預(yù)的HVSMCs 中過表達(dá)或低表達(dá)，這表明可能有多種LncRNA 參與了DPP4 誘導(dǎo)HVSMCs 增殖和遷移的調(diào)控過程。

為進(jìn)一步探究LncRNA對HVSMCs的增殖遷移的調(diào)控作用。選取其中上調(diào)明顯的LncRNA ENST-00000565307 作為實(shí)驗(yàn)的研究對象，同時在http：//genome.ucsc.edu 中查找到LncRNA ENST00000565-307 位于16 號染色體，是（MMP-2）的天然反義基因。通過RT-qPCR 技術(shù)驗(yàn)證，DPP4 干預(yù)HVSMCs 48 h 后，LncRNA ENST00000565307 的表達(dá)顯著上調(diào)。通過沉默LncRNA ENST00000565307 后，且CCK-8 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HVSMCs 的增殖受到抑制。RTqPCR 結(jié)果顯示，MMP-2 的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。在劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)中，沉默LncRNA ENST-00000565307 后，HVSMCs 的增殖遷移能力受到抑制。研究結(jié)果表明，DPP4可能是通過促進(jìn)LncRNA ENST00000565307的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控HVSMCs 的增殖及遷移過程。

本實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了DPP4 通過誘導(dǎo)LncRNA ENST00000565307 的過表達(dá)從而促進(jìn)HVSMCs 的增殖和遷移，還缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？傮w而言，LncRNA ENST00000565307 能否作為血管動脈粥樣硬化疾病防治的新靶點(diǎn)，還需要更進(jìn)一步的深入研究。