湯石林， 彭良善， 趙正亮， 譚一清， 顏 波， 王橋生

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南衡陽(yáng)421001）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是各種心肌損害發(fā)展至終末階段的共同病理特征，可誘發(fā)心律失常，心肌炎和心力衰竭，是導(dǎo)致心源性猝死的潛在危險(xiǎn)因素。因此，改善或逆轉(zhuǎn)MF是治療心血管疾病的重要策略［1］。MF是肌成纖維細(xì)胞過度增殖，膠原過度沉積及異常分布所引起的病理過程。以往研究認(rèn)為，肌成纖維細(xì)胞主要來源于局部組織中的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。新近研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是肌成纖維細(xì)胞的重要來源之一［2-3］。相關(guān)研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞可在多種因素刺激作用下逐漸失去其形態(tài)和功能，并獲得間充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞表型及其生物學(xué)特性，即發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，End-MT）［4］。因此，深入探究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程可為MF的治療提供參考依據(jù)。

1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）屬于鞘磷脂代謝產(chǎn)物，能夠通過S1P受體1～5（S1Preceptor 1～5，S1PR1～5）激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、分化、增殖、遷移等生物學(xué)功能，或以胞內(nèi)第二信使的方式發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究證實(shí)，S1P可通過S1PR1、S1PR3等參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化等過程［5-6］。此外，S1P能夠顯著增加間充質(zhì)干細(xì)胞的抗纖維化能力［7］，說明S1P可能在抑制心肌纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。但是，S1P抑制心肌纖維化的作用是否依賴S1PR以及End-MT是否在其中發(fā)揮功能，有待進(jìn)一步探討。

Smads家族蛋白作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）受體下游重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在TGF-β誘導(dǎo)的End-MT經(jīng)典模型中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［8］。研究表明，在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化過程中，S1PR1能夠抑制Smad3信號(hào)通路，進(jìn)而拮抗TGF-β功能［9］。然而，S1P介導(dǎo)的S1PR1信號(hào)途徑是否可通過調(diào)節(jié)Smad3信號(hào)通路影響TGF-β誘導(dǎo)的End-MT尚不明確。本研究擬通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）觀察S1P及其受體在TGF-β誘導(dǎo)的End-MT中的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為抑制心肌纖維化及其誘發(fā)的心功能不全提供參考資料。

材料和方法

1 材料與試劑

HUVECs購(gòu)自ATCC。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Gibco；小鼠抗人CD31單克隆抗體、小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體和重組人S1P蛋白購(gòu)自Abcam；小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體和兔抗人成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1）多克隆抗體購(gòu)自 Sigma；兔抗人Smad3單克隆抗體和兔抗人p-Smad3抗體購(gòu)自Thermo Fisher；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自武漢博士德公司；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度超過80%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞、傳代培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分為TGF-β（10 μg/L［10］）組、TGF-β+S1P（200 nmol/L［11］）組和 TGF-β+S1P+VPC23019（10 μmol/L［12］；S1PR1抑制劑）組。

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞裂解液，并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）矯正蛋白濃度，煮沸 5～8 min，冷卻，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肧DS-PAGE（80 V，30 min；120 V，90 min）分離蛋白；轉(zhuǎn)膜（200 mA，2 h）；TBST封閉液（含5%脫脂奶粉）封閉2 h；按比例稀釋CD31、VE-cadherin、α -SMA、FSP1、GAPDH 和 p-Smad3抗體，4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；經(jīng)ECL顯影劑處理后，采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照分析。

2.3 免疫熒光染色 24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，加入處理因素后，PBS浸洗3次，每次3 min；4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS浸洗3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透30 min；PBS浸洗3次，每次3 min；正常山羊血清工作液室溫封閉30 min；棄封閉液，I抗工作液4℃孵育過夜；PBS浸洗3次，每次3 min；熒光Ⅱ抗37℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，每次3 min；倒置熒光相差顯微鏡拍照觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

Western blot檢測(cè)End-MT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示，與TGF-β組相比，S1P+TGF-β組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2 S1P通過S1PR1降低TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

Figure 1.S1Pinhibited TGF-β-induced End-MT.The expression of CD31（A），VE-cadherin（B），α-SMA（C）and FSP1（D）was determined by Western bolt.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs TGF-β group.圖1 S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

為了進(jìn)一步證實(shí)S1PR1在S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT中的作用，我們采用S1PR1抑制劑VPC23019處理HUVECs。結(jié)果顯示，與S1P+TGF-β組相比，S1P+TGF-β+VPC23019組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見圖2。

3 S1PR1抑制劑VPC23019下調(diào)S1P作用下HUVECs中Smad3活性

與TGF-β處理組相比，S1P顯著降低了HUVECs中Smad3的磷酸化水平，并抑制其核轉(zhuǎn)位（P＜0.05）；而添加S1PR1抑制劑VPC23019處理后，S1P降低Smad3磷酸化及核轉(zhuǎn)位的作用被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖3。

討 論

End-MT能夠進(jìn)一步增加間充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞，尋找調(diào)控End-MT的策略對(duì)有效控制和減輕心肌纖維化及其誘發(fā)的各類心血管疾病具有重要意義［13-14］。S1P作為細(xì)胞鞘脂類物質(zhì)的代謝活性物質(zhì)，其相關(guān)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程、內(nèi)皮細(xì)胞生存及功能過程中發(fā)揮重要作用。鑒于S1P在心肌及內(nèi)皮細(xì)胞中的功能，我們推測(cè)S1P可能通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化參與心肌功能的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，S1P具有抑制TGF-β誘導(dǎo)的HUVECs的End-MT功能，說明S1P抑制心肌纖維化的功能可能部分依賴于其對(duì)End-MT進(jìn)程的抑制作用。

S1P作為胞內(nèi)第二信使，可直接特異性結(jié)合組蛋白脫乙酰酶 1/2（histone deacetylases 1/2，HDAC1/HDAC2），抑制其活性，進(jìn)而增強(qiáng)組蛋白H3乙?；潭?，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［15］。HDAC1被證實(shí)在上皮-間 充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［16］，而 End-MT 是EMT的一種特殊類型，提示S1P介導(dǎo)胞內(nèi)HDAC1的變化可能參與了其對(duì)End-MT的調(diào)節(jié)。S1PR1作為S1P在內(nèi)皮細(xì)胞中的受體之一，是介導(dǎo)S1P發(fā)揮功能的關(guān)鍵蛋白［17］。相關(guān)研究表明，S1P受體激動(dòng)劑FTY720能夠通過抗炎和抗凋亡途徑降低異位心臟移植后心肌纖維化水平［18］。本研究也表明，S1PR1抑制劑VPC23019能夠顯著逆轉(zhuǎn)S1P對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的End-MT的作用，說明S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT依賴S1PR1。

另外，我們利用Western blot及免疫熒光染色證實(shí)，S1P可能通過S1PR1途徑降低Smad3的磷酸化水平和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而影響TGF-β誘導(dǎo)的End-MT進(jìn)程。然而，在本研究中，我們僅觀察了S1P-S1PR1軸對(duì)Smad3信號(hào)的影響，而S1P對(duì)TGF-β介導(dǎo)的End-MT的具體調(diào)節(jié)機(jī)制是否依賴于Smad途徑，以及是否存在非Smad依賴信號(hào)途徑尚不清楚。

Figure 2.S1Pinhibited TGF-β-induced End-MTthrough S1PR1.The expression of CD31（A），VE-cadherin（B），α-SMA（C）and FSP1（D）was detected by Western bolt.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs TGF-β group；#P＜0.05 vs TGF-β+S1Pgroup.圖2 S1P經(jīng)S1PR1途徑抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

Figure 3.The effect of S1Pand S1PR1 on Smad3 signaling under the action of TGF-β.A：the phosphorylation level of Smad3 was detected by Western blot；B：the nuclear translocation of Smad3 was detected by immunofluorescence staining.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs TGF-β group；#P＜0.05 vs TGF-β+S1Pgroup.圖3 S1P及S1PR1對(duì)TGF-β作用下Smad3信號(hào)的影響

綜上所述，本研究在體外證實(shí)S1P-S1PR1可抑制TGF-β誘導(dǎo)的HUVECs的End-MT，其機(jī)制可能與Smad3磷酸化及核轉(zhuǎn)位有關(guān)。