尹樂(lè)斌，周娟，何平，廖聰，楊愛(ài)蓮，劉丹，李立才

1(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000) 2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng)，422000)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能夠利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]。研究表明,乳酸菌有多種益生功能，包括促進(jìn)食物的消化和吸收、降低血液中膽固醇的含量、緩解乳糖不耐癥、改善便秘、抗腫瘤及預(yù)防衰老[2-4]等，被廣泛用于改善食品風(fēng)味[5]、提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]及提高食品保藏性和附加值[7]等方面。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白得到不同分子質(zhì)量的寡肽[8]，因此，用乳酸菌發(fā)酵制備生物活性肽也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

大豆多肽是大豆蛋白的水解產(chǎn)物，具有多種生理活性功能，包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性[9-10]、抗氧化活性[11-13]、抗腫瘤活性[14]等。目前生產(chǎn)大豆多肽的主要原料為大豆粕、大豆分離蛋白、大豆粉等，采用的方法主要有酶水解法和發(fā)酵法，利用大豆加工廢水生產(chǎn)大豆活性多肽目前還未見(jiàn)報(bào)道。豆清液俗稱黃漿水，是傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)過(guò)程中蹲腦和壓榨工序產(chǎn)生的廢水，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括多糖、蛋白質(zhì)及其他生理活性成分[15]，直接排放會(huì)導(dǎo)致河水的生物需氧量(biology oxygen demmand, BOD)值和化學(xué)需氧量(chemical oxygen demmand, COD)值升高，不僅造成環(huán)境污染，同時(shí)也是資源浪費(fèi)。目前，有關(guān)豆清液綜合利用的研究主要集中在功能物質(zhì)提取[16-17]、豆清液發(fā)酵制品及凝固劑的制備[18-19]、豆清液新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[20-21]等，利用益生菌發(fā)酵豆清液制備生物活性多肽還鮮有報(bào)道。本研究利用乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)胞外酶水解豆清液制備大豆多肽，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，以期為豆清液綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆清液,本實(shí)驗(yàn)室提供；乳酸菌,本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；牛血清蛋白,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三氯乙酸(TCA),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸) [2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH),上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面(垂直)凈化工作臺(tái),江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；UV2900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),上海恒平科學(xué)儀器有限公司；Velocity V18 R高速冷凍離心機(jī),Dynamica Scientific Ltd；DH-360AB電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京中興偉業(yè)有限公司；FE28型pH計(jì),Mettler Toledo；冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽工藝

菌種活化、馴化→調(diào)整菌體濃度為108CFU/mL

↓

豆清液收集→分裝→滅菌→調(diào)pH→乳酸菌發(fā)酵制備多肽粗發(fā)酵液→離心→調(diào)節(jié)pH至7→測(cè)定多肽含量→冷凍干燥→-20 ℃保藏備用→測(cè)定抗氧化活性

1.3.2 乳酸菌菌種活化

將凍存管中菌種室溫解凍后于30 ℃水浴30 min，再轉(zhuǎn)接于20 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；然后將菌種劃線到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2代，得到活化的菌種；用無(wú)菌水將平板上的菌種洗下轉(zhuǎn)接至豆清液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，調(diào)整種子液中菌體濃度為108CFU/mL得到種子液，保證每次實(shí)驗(yàn)菌種活化代數(shù)一致。

1.3.3 豆清液多肽含量的測(cè)定

參考魯偉等[22]的方法略作修改：將樣品溶液與100 g/L的TCA溶液按1∶1的體積比混合均勻，室溫下靜置10 min，在7 000 r/min條件下離心15 min，取上清液按V(樣液)∶V(雙縮脲試劑)=3∶2的混合均勻，室溫下靜置30 min，測(cè)定吸光度值(空白用去離子水代替樣品)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多肽質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)，根據(jù)公式(1)計(jì)算多肽產(chǎn)率：

(1)

1.3.4 復(fù)合發(fā)酵菌種配比

將實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的乳酸菌明串珠菌M-6(LeuconostocmesenteroidesM-6)、植物乳桿菌3-2(Lactobacillusplantarum3-2)、玉米乳桿菌5-1(Lactobacilluszeae5-1)、副干酪乳桿菌5-2(Lactobacilluscasei5-2)、干酪乳桿菌2-1(Lactobacilluscasei2-1)、鼠李糖乳桿菌3-1(Lactobacillusrhamnosus3-1)(分別簡(jiǎn)稱為M-6、3-2、5-1、5-2、2-1、3-1)，分別接種至滅菌的豆清液中，以多肽產(chǎn)率為考察指標(biāo)，挑選去除多肽產(chǎn)率最低的乳酸菌，再對(duì)剩下的乳酸菌進(jìn)行每3株1∶1∶1復(fù)配，挑選出多肽產(chǎn)率最高的復(fù)配組合菌，確定發(fā)酵菌種。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

(1)菌種添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽產(chǎn)率的影響

固定菌種配比(3-1∶5-1∶5-2)為1∶1∶1，初始pH為6.4，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16 h，菌種添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)探究菌種添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響。

(2)初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽產(chǎn)率的影響

固定菌種配比(3-1∶5-1∶5-2)為1∶1∶1，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16 h，菌種添加量4%，初始pH分別為5.2、5.6、6.0、6.4、6.8探究初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響。

(3)發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽產(chǎn)率的影響

固定菌種配比(3-1∶5-1∶5-2)為1∶1∶1，初始pH為6.4，發(fā)酵時(shí)間為16 h，菌種添加量4%，發(fā)酵溫度分別為27、32、37、42、47 ℃探究發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響。

(4)發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽產(chǎn)率的影響

固定菌種配比(3-1∶5-1∶5-2)為1∶1∶1，初始pH為6.4，菌種添加量4%，發(fā)酵溫度為42 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為8、12、16、20、24 h，探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響。

1.3.6 大豆多肽工藝制備工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取菌種添加量(A)、初始pH(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為變量因素，采用響應(yīng)面分析法中Box-Menken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 體外抗氧化活性測(cè)定

·OH清除率測(cè)定參考DOU等[23]的方法；ABTS自由基清除率測(cè)定參考等YILMAZ-ERSAN等[24]的方法；DPPH自由基清除率測(cè)定參考MOYO等[25]的方法。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，用Office Excel 2003進(jìn)行誤差分析；SPSS進(jìn)行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性分析；Origin 9.0進(jìn)行繪圖及Design-Expert V 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)室確定的6株乳酸菌中篩選適合發(fā)酵豆清液制備多肽的乳酸菌，從圖1可以看出，6株乳酸菌都具有產(chǎn)多肽的能力，其中3-2相較于其他菌株的產(chǎn)多肽能力較差，因此將除3-2以外的其余菌株每3個(gè)復(fù)配并與純種發(fā)酵的豆清液多肽產(chǎn)率進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。

圖1 不同菌種對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of different strains on polypeptide yield注：不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖2 不同菌種復(fù)配對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of different mixed strains on polypeptide yield

總體來(lái)說(shuō)，復(fù)配發(fā)酵豆清液的多肽產(chǎn)率高于純種發(fā)酵豆清液的多肽產(chǎn)率。2-1、5-1、5-2組合與3-1、5-1、5-2多肽產(chǎn)率最高，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異，結(jié)合實(shí)驗(yàn)具體條件干酪乳桿菌2-1生長(zhǎng)緩慢不易培養(yǎng)，因此選擇3-1、5-1、5-2復(fù)配為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需菌種。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 菌種添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響

菌種添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽的影響如圖3所示，呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)菌種添加量為4%時(shí)，多肽產(chǎn)率最高，這表明并不是接種量越高乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽的產(chǎn)率就越高。在一定范圍內(nèi)適量地增加接種量有利于菌種適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境縮短遲緩期的時(shí)間，盡快達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；但是當(dāng)乳酸菌接種量過(guò)大時(shí)發(fā)酵體系中乳酸菌快速達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，一方面產(chǎn)蛋白酶的速度較對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期慢，另一方面，產(chǎn)乳酸速度增加這些因素都導(dǎo)致多肽產(chǎn)率降低。因此確定4%為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的接種量。

圖3 菌種添加量對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of the amount of bacteria added on thepolypeptide yield

2.2.2 初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響

pH對(duì)微生物的影響主要包括影響大分子物質(zhì)、核酸等的電荷變化，影響細(xì)胞膜的電荷變化會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其次就是對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)毒性的改變[26]，除了對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響以外，初始pH對(duì)乳酸菌產(chǎn)蛋白酶的能力也有一定影響[27]。在乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽的實(shí)驗(yàn)中多肽產(chǎn)率同初始pH的關(guān)系如圖4所示。從圖4中可以看出，多肽產(chǎn)率隨著初始pH的變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為6.4時(shí)多肽產(chǎn)率最高為36.3%。因此，選擇pH值為6.4的條件對(duì)后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 初始pH對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of initial pH on polypeptide yield

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響

溫度高低主要影響微生物的代謝活動(dòng)，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高，乳酸菌的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，但是如果溫度過(guò)高，乳酸菌菌株蛋白發(fā)生變性沉降自代謝能力從而受到限制[28](見(jiàn)圖5)。溫度為27～32 ℃時(shí)多肽產(chǎn)率上升明顯，32～42 ℃時(shí)變化趨勢(shì)不大，說(shuō)明乳酸菌生長(zhǎng)對(duì)溫度有一定的適應(yīng)性，從結(jié)果中可以看出當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)，多肽產(chǎn)率最高。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on polypeptide yield

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽產(chǎn)率的影響如圖6所示，在發(fā)酵初期多肽產(chǎn)率略微有所增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為達(dá)到8 h時(shí)產(chǎn)率有所降低，8～12 h持續(xù)增加并在12 h達(dá)到最高，后呈緩慢降低趨勢(shì)。出現(xiàn)這種情況的原因可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期，菌種需要生長(zhǎng)繁殖因此開(kāi)始分泌胞外酶切割蛋白質(zhì)，但是菌種在前期適應(yīng)環(huán)境階段需要蓄積大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此大部分氨基酸、多肽和小分子寡肽被乳酸菌利用導(dǎo)致發(fā)酵液中多肽含量降低[10, 29]。當(dāng)乳酸菌度過(guò)適應(yīng)期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后，胞外酶分泌量加大發(fā)酵液中多肽含量增加。而乳酸菌產(chǎn)胞外酶的主要作用是為了滿足自身生長(zhǎng)需要，穩(wěn)定期以后的乳酸菌開(kāi)始大量吸收肽類物質(zhì)并產(chǎn)乳酸，胞外酶分泌減少，隨著時(shí)間增加部分多肽進(jìn)一步水解成為氨基酸，從而導(dǎo)致多肽產(chǎn)率下降。綜上所述確定發(fā)酵12 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on polypeptide yield

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與優(yōu)化結(jié)果

以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)，確定菌種添加量(A)、初始pH(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)為響應(yīng)面優(yōu)化的響應(yīng)變量，借助Design-Expert 8.0.6.1軟件Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)，以樣品的多肽產(chǎn)率(Y)為響應(yīng)值，對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimentdesign

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

續(xù)表2

試驗(yàn)編號(hào)A菌種添加量/%B初始pHC發(fā)酵溫度/℃D發(fā)酵時(shí)間/h多肽產(chǎn)率/%14000059.7150-10-155.916-100144.917010-146.91800-1-152.519101046.1200-11051.921010157.32200-1151.723100-151.324000058.725110050.126000058.127-10-1045.128-110048.5291-10048.3

2.3.2 模型方程的建立及顯著性分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到多肽產(chǎn)率和4個(gè)因素之間的關(guān)系為：多肽產(chǎn)率(Y)=58.76+2.05A+0.84B-1.46C-0.38×D-0.85×A×B-1.70×A×C-0.90×A×D-2.67×B×C+5.45×B×D+0.40×C×D-7.46×A2-3.87×B2-4.12×C2-3.86×D2。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the constructedregression model

2.3.3 最佳發(fā)酵工藝的驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析得到乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽工藝的最佳條件為：菌種添加量為4.71%，初始pH值為6.44，發(fā)酵溫度為40.21 ℃，發(fā)酵時(shí)間為11.66 h。在此條件下經(jīng)軟件預(yù)測(cè)的多肽產(chǎn)率為(56.97±0.27)%。結(jié)合發(fā)酵過(guò)程實(shí)際操作方便，調(diào)整參數(shù)為：菌種添加量為4.70%，初始pH值為6.40，發(fā)酵溫度為40.00 ℃，發(fā)酵時(shí)間為12.00 h，經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得多肽產(chǎn)率為(57.33±0.32)%與預(yù)測(cè)值(56.97±0.27)%無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 ·OH清除率

對(duì)在最優(yōu)條件下發(fā)酵后的豆清液樣品進(jìn)行冷凍干燥并測(cè)定其體外抗氧化活性。從圖7-a中可以看出，經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后的豆清液干燥樣·OH清除率高于未發(fā)酵的豆清液干燥樣，這可能和發(fā)酵后豆清液中多肽含量增高有關(guān)。發(fā)酵和未發(fā)酵的豆清液干燥樣對(duì)·OH清除率的EC50分別是17.84和21.51 mg/mL，但和對(duì)照品Vc(圖7-b EC50為0.006 4 mg/mL)相比活性還較低。

2.4.2 ABTS清除率

經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后豆清液對(duì)ABTS自由基的清除率有明顯提高如圖8-a所示，未發(fā)酵的豆清液干燥樣的EC50為1.14 mg/mL，發(fā)酵過(guò)后的豆清液干燥樣的EC50為0.24 mg/mL，比未發(fā)酵樣品提高了4.75倍，圖8-b是Vc對(duì)ABTS的清除率與Vc濃度的關(guān)系，其EC50為0.011 mg/mL。通過(guò)對(duì)比可以得出和·OH清除率相比，樣品對(duì)ABTS自由基的清除率更強(qiáng)。

2.4.3 DPPH清除率

豆清液發(fā)酵前后及Vc對(duì)DPPH的清除情況見(jiàn)圖9，從圖9中可以看出經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后豆清液對(duì)DPPH的清除率有所上升，EC50由7.61 mg/mL降低到了3.53 mg/mL，清除率增加了1.16倍，清除率較強(qiáng)，但是和Vc(EC50=0.007 48 mg/mL)對(duì)照相比還是一定的差距。

圖7 多肽樣品及Vc濃度對(duì)·OH清除率的影響Fig.7 ·OH radical-scavenging activity of peptide and Vc

圖8 多肽樣品及Vc質(zhì)量濃度對(duì)ABTS自由基清除率的影響Fig.8 ABTS radical-scavenging activity of peptide and Vc

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的乳酸菌發(fā)酵豆清液制備大豆多肽的工藝條件為菌種添加量為4.71%、初始pH為6.44、發(fā)酵溫度為40.21 ℃、發(fā)酵時(shí)間為11.66 h，模型預(yù)測(cè)多肽產(chǎn)率為(56.97±0.27)%。

圖9 樣品及Vc質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.9 DPPH radical-scavenging activity of peptide and Vc

結(jié)合發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)際情況調(diào)整工藝參數(shù)為：菌種添加量為4.70%，初始pH值為6.40、發(fā)酵溫度為40.00℃、發(fā)酵時(shí)間為12.00 h，經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得多肽產(chǎn)率為(57.33±0.32)%與理論預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異(P>0.05)。

豆清液發(fā)酵前后的體外抗氧化活性測(cè)定表明，發(fā)酵后的豆清液多肽對(duì)·OH、ABTS自由基、DPPH自由基清除的EC50分別為17.84、1.14和7.61 mg/mL，較發(fā)酵前分別提高了1.2、4.75和2.16倍。