戴小芳　陳瓊　董華夏　向春燕　虞偉明　酈娟

摘 要：將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）、羥基萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB）與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)相結(jié)合，建立一種可視化PMA-HNB-LAMP方法快速檢測畜禽肉中單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）。結(jié)果表明，當(dāng)PMA終質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、孵育和曝光時間均為15 min時，可有效抑制105 CFU/mL的單核細胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，而對活菌DNA的擴增不具有抑制作用。LAMP反應(yīng)體系中HNB終濃度為210 μmol/L時，檢測顯色結(jié)果肉眼可見。該方法的純菌液靈敏度為2.4×102 CFU/mL，人工污染肉制品的檢出限為2.3×104 CFU/ mL。分別采用國標(biāo)法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法檢測20 份市售畜禽肉樣，3 種方法的單核細胞李斯特菌檢出率分別為5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解決LAMP法的假陽性問題，并且具有操作簡單、可視性強的優(yōu)點。

關(guān)鍵詞：單核細胞李斯特菌;疊氮溴化丙錠;羥基萘酚藍;環(huán)介導(dǎo)等溫擴增;畜禽肉

Abstract： Using propidium monoazide （PMA） treatment and hydroxynaphthol blue （HNB） staining combined with loop-mediated isothermal amplification， a rapid and visual detection method （PMA-HNB-LAMP） for Listeria monocytogenes was established in this study. The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 5.0 μg/mL，?incubation time of 15 min and exposure time of 15 min could restrain DNA amplification of 105 CFU/mL dead cells but not of live cells. A final HNB concentration of 210 μmol/L could give results visible to the naked eyes. The sensitivity of the PMA-HNB-LAMP method was 2.4 × 102 CFU/mL for pure bacterial culture. The detection limit for artificially contaminated meat was?2.3 × 104 CFU/mL. Using the national standard method， PMA-HNB-LAMP and HNB-LAMP， the detection rates of L. monocytogenes in 20 meat products available on the market were 5%， 10% and 20%， respectively. PMA-HNB-LAMP is superior to traditional LAMP in avoiding false-positive results to a certain extent， and it has the advantages of simple operation and strong visibility.

Keywords： Listeria monocytogenes; propidium monoazide; hydroxynaphthol blue; loop-mediated isothermal amplification; poultry and livestock meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-009

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）05-0048-05

單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病致病菌，該菌可引起腦膜炎、敗血癥、孕婦流產(chǎn)等[1-2]。單核細胞李斯特菌在-4～45 ℃的環(huán)境下均能生存，肉及肉制品是其主要污染源[3-4]。單核細胞李斯特菌的傳統(tǒng)微生物檢測方法需要經(jīng)過培養(yǎng)、分離和生化鑒定，時間一般為5～7 d[5]，這并不能滿足生產(chǎn)過程中品質(zhì)控制檢測時的限性要求，因此建立單核細胞李斯特菌的快速檢測方法顯得尤為重要。

單核細胞李斯特菌的快速檢測方法主要包括基于DNA水平的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[6-7]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法[8-9]、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）法[10]和數(shù)字PCR法[11]等，以及處于蛋白質(zhì)水平的基于免疫機制的方法[12-13]。LAMP技術(shù)由于不需要高溫變性、退火等步驟，因此在恒溫條件下就可實現(xiàn)目標(biāo)DNA的高效擴增，與PCR、定量PCR等技術(shù)在快速檢測場景中相比，具有簡便、快捷且無需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備等優(yōu)勢，是目前廣泛使用的恒溫核酸擴增技術(shù)之一[14-15]。

傳統(tǒng)的LAMP法仍存在一些不足。一方面，結(jié)果可視性不強。雖然LAMP反應(yīng)后會產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，并在定性檢測時可用肉眼直接觀察結(jié)果，但當(dāng)?shù)涂截惖哪０宕嬖跁r焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生較少，肉眼判斷困難。目前通常將LAMP反應(yīng)與凝膠電泳或濁度儀結(jié)合[16-17]，或者在反應(yīng)體系中加入熒光染料通過儀器進行判讀[18]，但這些改進措施都需要借助儀器。另一方面，LAMP等基于DNA擴增的檢測方法難以區(qū)分樣品中的“死菌”與“活菌”，因此易造成假陽性結(jié)果[19]。

羥基萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB）是一種金屬離子指示劑[20]，在LAMP反應(yīng)前添加HNB，反應(yīng)后的陰性管會呈紫羅蘭色，陽性管呈天藍色，因此可用于增強LAMP檢測結(jié)果的可視性。HNB-LAMP法檢測單核細胞李斯特菌，結(jié)果判定快速、直觀和簡便[21-22]。

疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）聯(lián)合LAMP技術(shù)可選擇性抑制死菌細胞DNA擴增[23-24]。Zhong Qingping等[25]運用PMA-LAMP技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），結(jié)果表明運用PMA-LAMP技術(shù)能在不受死細胞和其他細菌干擾的情況下檢測金黃色葡萄球菌的活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細胞。馬骉等[26]建立PMA-LAMP法檢測副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus），結(jié)果表明PMA-LAMP法可有效剔除死細胞和其他細菌干擾。Kragh等[27]用PMA-PCR法研究熱處理和干燥處理后的單核細胞李斯特菌活菌，結(jié)果表明PMA對活細胞檢測至關(guān)重要。本研究將PMA、HNB和LAMP技術(shù)結(jié)合，建立操作簡單、設(shè)備要求低、結(jié)果判定直觀的單核細胞李斯特菌活菌的可視化PMA-HNB-LAMP檢測方法，并將其用于畜禽肉中單核細胞李斯特菌的檢測，為食品企業(yè)在生產(chǎn)經(jīng)營環(huán)節(jié)品質(zhì)控制和病原菌現(xiàn)場檢測中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核細胞李斯特菌ATCC 19115、單核細胞李斯特菌分離株（B60、B62）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）ATCC 33090、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）ATCC 19119、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC 51329、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）FSCC 206546、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922、副溶血性弧菌FSCC 232009、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FSCC 206003，所用標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自美國典型菌種保藏中心，單核細胞李斯特菌分離株來自生雞肉中檢出的單核細胞李斯特菌陽性菌，-80 ℃保存于實驗室。

單核細胞李斯特菌增菌肉湯（LB1）、胰酪胨大豆瓊脂（含0.6%酵母浸膏）、PALCAM瓊脂、單核細胞李斯特菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Bst DNA聚合酶 New England Biolab公司;甜菜堿 美國Sigma公司;dNTPs、LAMP引物 生工生物工程（上海）股份有限公司;HNB（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司;PMA 美國Biotium公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;單核細胞李斯特菌免核酸提取核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法） 卡尤迪生物科技（北京）有限公司;可視化單核細胞李斯特菌核酸快速檢測試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WNB-45恒溫水浴箱 德國美墨爾特公司;A2生物安全柜 賽默飛世爾科技（中國）有限公司;CFX96 TOUCH-實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備

將-80 ℃保存的單核細胞李斯特菌活化后接種到LB1增菌液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，以此為菌原液。吸取1 mL菌原液加入9 mL無菌生理鹽水中制成1∶10菌液，充分混勻后吸取1 mL菌液到9 mL無菌生理鹽水中制成1∶100菌液，重復(fù)上述步驟制成10 倍系列梯度稀釋菌液，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取各梯度稀釋菌液制備DNA模板，同時采用平板計數(shù)法對各梯度稀釋菌液進行菌落計數(shù)。

1.3.2 死菌的制備

采用高溫煮沸法制備死菌用于PMA處理。將上述各梯度單核細胞李斯特菌稀釋菌液于100 ℃加熱10 min，作為死菌液。在30 ℃培養(yǎng)48 h以上進行平板計數(shù)，以確保無活菌生長。

1.3.3 PMA處理的優(yōu)化

參考文獻[28-29]進行PMA處理，將單核細胞李斯特菌死菌液菌體濃度調(diào)整為105 CFU/mL，分別加入質(zhì)量濃度5、10、20、30、40、50 ?g/mL的PMA，室溫避光孵育15 min后，LED藍光儀曝光15 min。按照試劑盒說明書進行PCR擴增，確定能夠抑制105 CFU/mL單核細胞李斯特菌死菌DNA擴增的PMA質(zhì)量濃度范圍。在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對單核細胞李斯特菌活菌（菌體濃度103～105 CFU/mL）進行PMA處理，確定對死菌DNA擴增抑制效率最高但不能抑制活菌DNA擴增的PMA質(zhì)量濃度。

1.3.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

采用SN/T 2754.4—2011《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（LAMP）檢測方法 第4部分：單核細胞增生李斯特菌》中的反應(yīng)體系[30]。反應(yīng)體系體積25 ?L，包括1.6 mmol/L dNTPs 4 ?L、8.0 mmol/L MgSO4溶液1 ?L、1.6 ?mol/L FIP引物1 ?L、1.6 ?mol/L BIP引物1 ?L、0.2 ?mol/L F3引物0.5 ?L、0.2 ?mol/L B3引物0.5 ?L、0.8 mol/L甜菜堿4 ?L、0.16 U/?L Bst DNA聚合酶0.5 ?L、1×ThermoPol 2.5 ?L、DNA模板2.5 ?L、去離子水7.5 ?L。引物序列如表1所示。

1.3.5 HNB濃度的優(yōu)化

取1 mL菌體濃度107 CFU/mL菌液提取DNA，以超純水作空白對照。在建立的反應(yīng)體系中分別添加終濃度為240、210、180、150、120、90、60、30 ?mol/L的HNB，按照1.3.4節(jié)進行LAMP擴增反應(yīng)，通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。陽性為天藍色，陰性為紫羅蘭色，以顏色差別明顯、利于觀察為標(biāo)準(zhǔn)確定最適宜HNB濃度。

1.3.6 HNB-LAMP法檢測單核細胞李斯特菌的特異性與靈敏度分析

按照1.3.1節(jié)方法分別提取各受試菌株DNA，在上述優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中進行擴增，驗證其特異性。將制備的10 倍系列單核細胞李斯特菌稀釋菌液的DNA模板按照前文建立的HNB-LAMP反應(yīng)體系進行擴增，進行靈敏度分析。

1.3.7 肉制品中單核細胞李斯特菌的檢出限分析

取25 g火腿腸（已檢測未污染目標(biāo)菌）加入225 mL無菌LB1中，均質(zhì)2 min，制備樣品勻漿。分別取1 mL 10 倍系列梯度稀釋菌液加入9 mL樣品勻漿中，混勻，平板計數(shù)法確定實際菌落數(shù)。提取樣品勻漿中目標(biāo)菌模板DNA，在優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中進行擴增，確定檢出限。

1.3.7 PMA-HNB-LAMP法檢測人工污染單核細胞李斯特菌樣品和實際冷凍畜禽肉樣品

從市售熟肉制品中選取2 個樣品（已檢測未污染目標(biāo)菌）制備樣品勻漿，分別人工污染約105 CFU/mL單核細胞李斯特菌活菌和死菌。按照GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法分別進行檢測。PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法直接取人工污染的樣品勻漿，提取DNA進行后續(xù)檢測。國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測時需將人工污染樣品勻漿，于30 ℃培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)檢測。隨機選取市售冷凍畜肉和冷凍禽肉樣品各10 份，按上述方法進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA處理法的優(yōu)化結(jié)果

1～7. PMA質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、30、40、50 ?g/mL。

由圖1可知，質(zhì)量濃度5～50 ?g/mL的PMA處理105 CFU/mL的單核細胞李斯特菌死菌后，實時PCR擴增結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度的PMA處理組均能完全抑制105 CFU/mL單核細胞李斯特菌死菌DNA擴增。

1～9. PMA質(zhì)量濃度/（μg/mL）/活菌濃度/（CFU/mL）分別為0/103、0/104、0/105、5/103、5/104、5/105、10/103、10/104、10/105。

以質(zhì)量濃度5、10 ?g/mL的PMA分別處理菌體濃度103、104、105 CFU/mL的單核細胞李斯特菌活菌菌液。由圖2可知：5 ?g/mL PMA處理不能抑制單核細胞李斯特菌活菌的DNA擴增;10 ?g/mL PMA處理能夠抑制菌體濃度為103 CFU/mL單核細胞李斯特菌活菌的DNA擴增，但菌體濃度（104、105 CFU/mL）較高時，不具有抑制作用。最終確定單核細胞李斯特菌的PMA處理最佳參數(shù)為室溫避光孵育15 min、曝光15 min、PMA質(zhì)量濃度5 ?g/mL。

2.2 可視化HNB-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

1. 單核細胞李斯特菌;2. 空白對照組。A～H. HNB濃度分別為30、60、90、120、150、180、210、240 ?mol/L。

由圖3可知，HNB濃度為180～240 ?mol/L時，陰性反應(yīng)管（空白對照組）與陽性反應(yīng)管顏色對比明顯。因此，選擇HNB濃度210 ?mol/L。

2.3 可視化HNB-LAMP法的特異性與靈敏度結(jié)果

1～6. 稀釋倍數(shù)分別為102、103、104、105、106、107;7. 陽性對照;8. 陰性對照。A. HNB-LAMP反應(yīng)體系;B. 市售鈣黃綠素-LAMP試劑盒。

各受試菌株DNA在優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中擴增以驗證方法特異性。僅單核細胞李斯特菌ATCC19115、單核細胞李斯特菌分離株B60和B62反應(yīng)管為陽性，呈天藍色，其余受試菌株反應(yīng)管均呈紫羅蘭色，表明該方法具有特異性。通過平板計數(shù)確定各梯度稀釋菌液的菌體濃度為2.4×102～2.4×107 CFU/mL。由圖4可知，各梯度稀釋菌液反應(yīng)管均呈天藍色，表明可視化HNB-LAMP法的純菌液檢測靈敏度達到102 CFU/mL，與市售鈣黃綠素-LAMP試劑盒的反應(yīng)結(jié)果一致。

2.4 人工污染肉制品中可視化HNB-LAMP法的檢出限分析結(jié)果

1～7. 菌體濃度分別為2.3×101、2.3×102、2.3×103、2.3×104、2.3×105、2.3×106、2.3×107 CFU/mL;8. 陽性對照;9. 陰性對照;10. 樣品勻漿。

取1 mL菌體濃度為2.3×102～2.3×108 CFU/mL的單核細胞李斯特菌菌液加入9 mL火腿樣品勻漿中，通過平板計數(shù)確定實際菌落數(shù)為2.3×101～2.3×107 CFU/mL。由圖5可知，菌體濃度為2.3×104～2.3×107 CFU/mL時，反應(yīng)管呈藍色，表明所建立的反應(yīng)體系對人工污染肉制品中單核細胞李斯特菌的檢出限為104 CFU/mL。

2.5 人工污染單核細胞李斯特菌樣品和實際冷凍畜禽肉樣品檢測結(jié)果

傳統(tǒng)微生物方法、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測人工污染活菌樣品的結(jié)果均為陽性;PMA-HNB-LAMP法和傳統(tǒng)微生物方法檢測人工污染死菌樣品的結(jié)果均為陰性，LAMP法檢測結(jié)果為陽性，表明PMA-HNB-LAMP法能抑制單核細胞李斯特菌死菌的擴增。

對于隨機選取的20 份冷凍畜禽肉樣品，HNB-LAMP法檢出陽性樣品4 個（樣品編號5、9、14、15），陽性率20%;PMA-HNB-LAMP法檢出陽性樣品2 個（樣品編號5、14），陽性率10%;傳統(tǒng)微生物方法檢出陽性樣品1 個（樣品編號14），陽性率5%。PMA-HNB-LAMP法與傳統(tǒng)微生物方法的檢測結(jié)果相比，樣品5檢出假陽性，這可能是由于PMA處理對該樣品中的死菌不具有抑制效果，也可能是存在非單核細胞李斯特菌的假陽性菌株。PMA-HNB-LAMP法與HNB-LAMP法的檢測結(jié)果相比，少檢出2 個陽性樣品，由于這2 個樣品的傳統(tǒng)微生物方法檢測結(jié)果也為陰性，說明該樣品中單核細胞李斯特菌的死菌數(shù)低于105 CFU/mL，其擴增經(jīng)過PMA處理后被抑制，也可能是HNB-LAMP法處理后出現(xiàn)了假陽性擴增現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

GB 29921—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》中規(guī)定：預(yù)包裝熟肉制品和即食生肉制品中每批次5 份樣品中均不得檢出單核細胞李斯特菌[31]。畜禽肉作為肉制品原料，是肉制品中單核細胞李斯特菌的主要污染來源之一。本研究將PMA、HNB和LAMP技術(shù)結(jié)合，建立用于檢測單核細胞李斯特菌的PMA-HNB-LAMP法，該方法特異性強，純菌液檢測靈敏度可達2.4×102 CFU/mL，檢測效果與市售試劑盒相當(dāng)。對人工污染畜禽肉樣品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)微生物方法一致;對實際畜禽肉樣品檢測時，該方法在一定程度上解決了由死菌擴增引起的假陽性問題，并且對設(shè)備要求簡單，因此可用于肉制品企業(yè)生產(chǎn)中的品質(zhì)控制。但是檢測結(jié)果中仍出現(xiàn)了假陽性結(jié)果，因此仍需作進一步研究。

此方法解決了LAMP技術(shù)的2 個方法學(xué)問題，即添加指示劑實現(xiàn)可視化檢測結(jié)果，以及區(qū)別檢測食品中單核細胞李斯特菌的死菌和活菌從而降低假陽性率。該方法克服了檢測設(shè)備簡單、檢測人員不足的困難，可推廣應(yīng)用于多種致病菌的檢測，為食品安全提供新的檢測思路和技術(shù)平臺支持。

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