陳洪江，羅紹偉，林海明，許建坤，黃鐘煉，黃澤彬，陳潔斌，許偉才，胡軍

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，廣東汕頭 515000)

自上世紀(jì)90年代，Haupt等[1]首先發(fā)現(xiàn)體外沖擊波(Extracorporeal Shock Wave，ESW)可促進(jìn)骨折愈合，此后，ESW已被證實(shí)可有效治療骨折延遲愈合或不愈合，其治愈率達(dá)70%。

骨折愈合需要多種細(xì)胞協(xié)調(diào)參與，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs作為一種多能干細(xì)胞，能分化產(chǎn)生骨、軟骨、肌腱、脂肪及肌肉等肌肉骨骼組織[4]。在骨折愈合早期炎癥反應(yīng)中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)從破壞的骨組織中釋放并募集骨膜及髓腔中的MSCs 至骨折區(qū)域，分化形成骨痂[6]。SDF-1即趨化因子CXCL12，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞[7]、骨膜細(xì)胞[8]及骨髓、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，且以自身反饋形式促進(jìn)MSCs 存活、增殖及分化[10]。

MSCs能表達(dá)一系列趨化因子受體，其中趨化因子受體4(CXCR4)即CXCL12的配體，被廣泛證實(shí)與MSCs 遷移相關(guān)[11]。ESW對(duì)骨髓MSCs的粘附、遷移、增殖、分化具有促進(jìn)作用，有研究表明MSCs 的粘附、分化能力相互影響，MSCs 粘附得越多則其成骨分化能力越強(qiáng)。MSCs分泌的SDF-1及表達(dá)的CXCR4受體能相互促進(jìn)MSCs向目標(biāo)骨組織遷移。

本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，探討適宜能量沖擊波促進(jìn)MSCs向成骨分化過(guò)程中SDF-1/CXCR4的作用，為沖擊波更廣泛應(yīng)用于骨科疾病臨床治療提供更全面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取24只4周齡雄性SD大鼠作為骨髓MSCs來(lái)源，選取48只12周齡雄性SD大鼠用于體內(nèi)試驗(yàn)，其外觀及反應(yīng)均良好。動(dòng)物均采購(gòu)并飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物的飼養(yǎng)和試驗(yàn)方案遵守中國(guó)試驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(衛(wèi)生部第55號(hào)文件)及汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)指南。

1.2 大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)及鑒定

取4周雄性SD大鼠以頸椎脫位處死，浸泡于75%酒精中5 min后移入超凈工作臺(tái)中，分離雙側(cè)股骨及脛骨并仔細(xì)剔除軟組織與骨膜，用PBS漂洗3次，然后用無(wú)菌注射器抽取完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液離心并用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL后接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，72 h后半量換液，以后隔3 d全量換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1：3比例傳代至第3代細(xì)胞以供實(shí)驗(yàn)使用[15]。將獲得的第3代細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，用茜素紅染色鑒定其成骨分化能力；用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，用油紅染色法鑒定其成脂分化的能力。

1.3 體外試驗(yàn)分組及大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的體外沖擊波處理

體外試驗(yàn)分空白對(duì)照組(Ctrl組)、沖擊波組(ESW組)及CXCR4特異抑制劑AMD3100組(AMD組)[16]。取第3代MSCs，與AMD3100 共培養(yǎng)24 h后，經(jīng)沖擊波處理作為AMD組細(xì)胞；ESW組細(xì)胞僅接受沖擊波處理；Ctrl組細(xì)胞未經(jīng)任何處理。各組細(xì)胞經(jīng)處理供后續(xù)使用，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL后，接種0.5 mL于6孔板，每組實(shí)驗(yàn)每時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3復(fù)孔供茜素紅染色、堿性磷酸酶染色及SDF-1蛋白分泌定量實(shí)驗(yàn)使用。

沖擊波處理方法：以0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取1.5 mL細(xì)胞懸液置于15 mL無(wú)菌聚丙乙烯管內(nèi)，使用本院泌尿外科惠康VI 型液電式體外沖擊波碎石機(jī)(惠康VI 型，深圳)，采用間接定位法確定體外沖擊波焦點(diǎn)，將聚乙烯管尖底部含細(xì)胞懸液部分充分固定于預(yù)先均勻涂抹有耦合劑的球囊壁，按照課題組前期運(yùn)用MTT法確定體外沖擊波適宜能量(500脈沖次數(shù)、10 kV)進(jìn)行體外第三代沖擊波處理用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 茜素紅染色

當(dāng)Ctrl組細(xì)胞達(dá)到100%融合度時(shí)，各組細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，于第5、10、15、20天進(jìn)行染色及定量分析。染色方法：吸凈培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，用95%酒精固定15 min，蒸餾水漂洗3 遍，然后加入1% 茜素紅染色液2 mL置室溫孵育10 min，蒸餾水飄洗后自然條件下干燥，然后顯微鏡下觀察并拍照記錄。茜素紅染色后量化的方法：將被染成深紅色的礦化鈣結(jié)節(jié)用1 mol/L的HCl溶液溶解后，通過(guò)測(cè)量在590 nm波長(zhǎng)的吸光度，對(duì)礦化鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行量化分析。

1.5 堿性磷酸酶染色

當(dāng)Ctrl組細(xì)胞達(dá)到100%融合度時(shí)，各組細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，于第5、10、15、20天進(jìn)行染色及定量分析。染色方法：吸凈培養(yǎng)基，PBS飄洗3遍，0.4%多聚甲醛固定10 min，PBS再次沖洗2遍并吸凈殘余液體。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制孵育工作液(堿性磷酸酶顯色緩沖液∶BCIP∶NBT= 300∶1∶2)，每個(gè)6孔板加入1 mL工作液，室溫避光孵育直至顯色至預(yù)期深淺，吸去工作液并用蒸餾水漂洗終止顯色反應(yīng)，自然條件下干燥后掃描記錄。

堿性磷酸酶的定量測(cè)定：各組細(xì)胞分別于第5、10、15、20天更換新鮮培養(yǎng)基，并于24 h后取上清液，按試劑盒操作說(shuō)明在酶標(biāo)板上分測(cè)定孔、3孔標(biāo)準(zhǔn)孔及3孔空白孔，每測(cè)定孔加入各組細(xì)胞上清液5 uL，每標(biāo)準(zhǔn)孔加入濃度為0.1 mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液5 uL，每空白孔加入雙蒸水5 uL。每孔繼續(xù)加入緩沖液50 uL、基質(zhì)液50 uL，充分混勻后，將酶標(biāo)板置于37 ℃水浴15 min，各孔加入顯色劑150 uL，輕輕振搖孔板均勻，在波長(zhǎng)520 nm下，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度。測(cè)定后計(jì)算堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量,公式如下:ALP(金氏單位)=(測(cè)定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度×100 mL,金氏單位定義:100 mL液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。

1.6 體外沖擊波促進(jìn)SDF-1分泌

經(jīng)處理后4、8、12、24 h收集各組培養(yǎng)基，采用雙抗體夾心ELISA法，用抗大鼠SDF-1單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的SDF-1與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠SDF-1，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測(cè)吸光度(OD)，SDF-1濃度與OD值成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中SDF-1濃度。

1.7 動(dòng)物模型制作及X線檢查

采用48只12周齡雄性SD大鼠制作右側(cè)股骨骨缺損模型，隨機(jī)分成Ctrl、ESW及AMD 3組各16只(術(shù)后第4、8周各8只)，PLGA支架置于各組細(xì)胞懸液(1×106/mL)中的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后備用。采用右側(cè)股骨中段骨缺損模型，各組骨缺損處植入載有該組細(xì)胞的PLGA支架，AMD組術(shù)后接受AMD3100注射(1 mg/kg/day)，于術(shù)后第4、8周取材。

模型制作方法：用1.5 %戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，備皮并用碘酒及酒精消毒，打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔后，從膝關(guān)節(jié)面置入合適大小的克氏針以獲得穩(wěn)定固定，分離右側(cè)股骨后，用鋼銼將右股骨中段銼出5 mm長(zhǎng)、1/2周徑的骨缺損，置入PLGA支架。術(shù)后使用X線檢查模型是否成功，切口定期換藥，連續(xù)3 d抗生素肌肉注射預(yù)防感染，AMD3100 融于生理鹽水(濃度1 mg/mL)對(duì)AMD組大鼠進(jìn)行腹腔注射(1 mg/kg/day)，余2組注射等量空白生理鹽水。

1.8 Micro-CT評(píng)估新形成骨情況

于術(shù)后第4 周和第8 周，頸椎脫位處死大鼠獲取右股骨標(biāo)本，取出克式針并剔除非缺損處的軟組織，用10%福爾馬林固定24 h后，置于micro-CT設(shè)備中掃描整個(gè)骨缺損區(qū)后供H-E染色及免疫組化使用

1.9 H-E染色及免疫組化

于術(shù)后第4、8 周拉頸處理大鼠，取右側(cè)股骨剔除肌肉，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24 h、10%EDTA脫鈣6周及乙醇梯度脫水等處理后，進(jìn)行石蠟連續(xù)切片(厚5 μm)，隨后通過(guò)H-E染色計(jì)算新生類骨質(zhì)相對(duì)面積評(píng)估骨缺損愈合情況，按照免疫組化試劑盒分析骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析法(ANOVA)用于進(jìn)行多組均數(shù)的比較，t檢驗(yàn)用于分析兩組之間各種均數(shù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及分化鑒定

從骨髓中獲取貼壁成長(zhǎng)的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下100倍鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈紡錘形、長(zhǎng)梭形等形態(tài)，大小形態(tài)均一并呈集落生長(zhǎng)[圖1(a)]。MSCs經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)3周后，肉眼可見(jiàn)大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色后呈現(xiàn)深紅色，說(shuō)明其具有良好的成骨分化能力[圖1(b)]；MSCs經(jīng)成脂分化誘導(dǎo)10 d后，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成，經(jīng)油紅染色后呈紅色，說(shuō)明其具有良好的成脂分化能力[圖1(c)]。結(jié)果顯示，MSCs具有良好的多向分化潛能。

2.2 茜素紅染色、ALP染色及分泌SDF-1測(cè)定

將Ctrl組、AMD組及ESW組的MSCs培養(yǎng)至Ctrl組細(xì)胞融合后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)(第5、10、15、20天)，分別進(jìn)行茜素紅染色及ALP染色，并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析。從圖2(a)結(jié)果可以看出，ESW組的鈣結(jié)節(jié)染上茜素紅的顏色明顯深于Ctrl組及AMD組，表現(xiàn)了明顯的成骨能力；ESW組大部分貼壁細(xì)胞的胞漿及胞外基質(zhì)被染成藍(lán)紫色的顏色明顯深于Ctrl組及AMD組，表現(xiàn)了強(qiáng)烈的ALP活性。從定量分析結(jié)果也可以看到[圖2(b)-(c)]，ESW組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第5、10、15、20天)的茜素紅吸光度及ALP活性染色明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。而ALP和鈣含量測(cè)定分別是成骨分化的早期和晚期的定量分析標(biāo)志性指標(biāo)，這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了ESW效應(yīng)促進(jìn)MSCs 成骨分化作用明顯增強(qiáng)，而這種增強(qiáng)效果可以被CXCR4受體拮抗劑AMD3100所部分抑制，僅存少許對(duì)MSCs成骨分化的作用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定SDF-1分泌型蛋白表達(dá)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。如圖2(d)結(jié)果示ESW組SDF-1分泌量較Ctrl、AMD組呈現(xiàn)顯著增高，隨著時(shí)間推移，SDF-1表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)均逐漸增多，且統(tǒng)計(jì)學(xué)有統(tǒng)計(jì)意義(4h時(shí)P<0.05；8、12 h時(shí)P<0.05；24h時(shí)P<0.001)。

2.3 大鼠骨缺損模型及骨愈合的Micro-CT 3D重建

選取外觀及反應(yīng)良好的12周齡雄性SD大鼠制造右側(cè)股骨干1/2骨缺損模型[圖3(a)]，將PLGA支架植入大鼠骨缺損部位[圖3(b)]，術(shù)后進(jìn)行X線檢查，了解股骨是否存在骨折及骨缺損情況，X線片顯示各組骨缺損克氏針內(nèi)固定情況良好以及骨缺損區(qū)域的骨缺損制作良好[圖3(c)]，白色箭頭指示骨缺損部位)。將各組股骨樣品收集起來(lái)，固定并行Micro-CT掃描。三維CT清晰顯示[圖3(d)]，PLGA支架植入的ESW組中，術(shù)后4周，支架附于骨缺損局部有骨痂形成，而Ctrl組及AMD組骨缺損部位邊緣較銳且局部未見(jiàn)明顯骨痂形成；術(shù)后8周時(shí)，支架植入的ESW組骨缺損部位均有豐富的骨痂形成，部分缺損區(qū)充滿了礦化骨痂，而Ctrl組及AMD組僅有少量礦化骨附于骨缺損邊緣。進(jìn)一步對(duì)CT掃描骨體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[圖3(e)]，結(jié)果提示PLGA支架植入的ESW組，較Ctrl組及AMD組明顯有更多的新生骨形成并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ESW對(duì)骨缺損的愈合具有明顯的促進(jìn)作用。

2.4 H-E染色及骨形成蛋白的免疫組化檢測(cè)

Ctrl組、AMD組及ESW組分別于4、8周后對(duì)大鼠股骨進(jìn)行取材、固定、脫鈣、切片，通過(guò)H-E染色觀察骨缺損部位的組織修復(fù)情況。染色結(jié)果顯示，在4周和8周，隨著支架的降解，ESW組比Ctrl組及AMD組明顯有更多的類骨質(zhì)組織形成；H-E染色結(jié)果[圖4(a)]及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果[圖4(b)]從組織學(xué)角度同樣表明，ESW具有可促進(jìn)骨缺損愈合的治療效果。

進(jìn)一步通過(guò)免疫組化檢測(cè)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損愈合區(qū)域組織中OPN表達(dá)情況[圖4(c)]，結(jié)果顯示ESW組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨缺損部位OPN的表達(dá)量明顯高于Ctrl組及AMD組，對(duì)骨缺損區(qū)域骨愈合中的OPN的光密度統(tǒng)計(jì)分析[圖4(d)]同樣顯示ESW組優(yōu)于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OPN免疫組化染色的結(jié)果，其表達(dá)趨勢(shì)與H-E染色結(jié)果保持一致，進(jìn)一步表明ESW效應(yīng)對(duì)骨缺損區(qū)域骨愈合的促進(jìn)作用。

3 討論

在本研究開(kāi)展前，前期相關(guān)研究表明ESW具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附及成骨分化作用，其推斷基礎(chǔ)之一就是間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、分化等生物行為之間存在相互聯(lián)系。已有研究利用原子力顯微鏡研究分析細(xì)胞骨架、粘附能力及其分化方向之間的關(guān)系，得到如下結(jié)論：具有結(jié)實(shí)及平鋪的肌動(dòng)蛋白骨架即粘附能力強(qiáng)的MSCs成骨分化趨勢(shì)更明顯，而具有圓球形、松散的激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架即粘附能力弱的MSCs成脂及成軟骨分化趨勢(shì)顯著。因此，如果一個(gè)特定的機(jī)械力可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的MSCs，將可能促進(jìn)MSCs的粘附。本研究團(tuán)隊(duì)早期發(fā)現(xiàn)ESW促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的黏附、遷移和成骨分化能力[18]，結(jié)合筆者所獲得的結(jié)果，即ESW作用能夠促進(jìn)MSCs粘附的研究發(fā)現(xiàn)，則再一次說(shuō)明了細(xì)胞生物行為之間的聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)股骨半缺損模型中應(yīng)用的PLGA具有很好的生物相容性，PLGA在此模型中提供了細(xì)胞支架作用，MSCs治療的首要基礎(chǔ)是其細(xì)胞的粘附及遷移，因此在PLGA提供細(xì)胞支架的基礎(chǔ)上可以大大利于MSCs向骨缺損區(qū)域的定向粘附與遷移，通過(guò)ESW組相對(duì)Ctrl組具有明顯促進(jìn)MSCs向成骨分化的作用，在組織學(xué)層面可以觀察到在骨缺損區(qū)有明顯類骨質(zhì)的骨痂形成；將PLGA制成具有容納MSCs孔隙的3D立體支架，在體外加載MSCs并進(jìn)行體外ESW處理，隨后植入骨缺損處，這種支架結(jié)合了材料和處理方法在成骨方面的優(yōu)點(diǎn)，是一種可通過(guò)體外預(yù)處理干細(xì)胞提高干細(xì)胞治療療效及應(yīng)用于骨折缺損修復(fù)的恰當(dāng)策略，本研究豐富了其應(yīng)用的基礎(chǔ)理論，并說(shuō)明了該策略的可能性及可行性。

圖1 (a)MSCs(3代)100 倍鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、紡綞形等形態(tài)，成集落樣生長(zhǎng)；(b)MSCs(3代)經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)后經(jīng)茜素紅染液染色，可見(jiàn)許多鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色(白色箭頭)；(c)MSCs(3代)經(jīng)成脂誘導(dǎo)10 d后進(jìn)行油紅染色，可見(jiàn)許多被油紅染成紅色的脂滴(白色箭頭)。

圖2 (a)成骨誘導(dǎo)20 d后，茜素紅染色及堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示ESW組的鈣結(jié)節(jié)染上茜素紅顏色明顯深于Ctrl組及AMD組；(b)Ctrl組、AMD組及ESW組深紅色的礦化鈣結(jié)節(jié)及測(cè)量吸光度(590 nm波長(zhǎng))，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的礦化鈣沉積進(jìn)行量化分析。(c)Ctrl組、AMD組及ESW組細(xì)胞檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的ALP活性定量值數(shù)據(jù)；(d)Ctrl、AMD及ESW三組在4、8、12及24 h的MSCs分泌SDF-1量分析，ESW在24 h相對(duì)Ctrl組、AMD組有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.01及P<0.05)；(n=3；*代表ESW組與 Ctrl組及AMD組比較的P 值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

圖4 (a)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)域骨愈合的組織切片H-E染色；(b)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)域骨愈合的類骨質(zhì)相對(duì)面積的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示ESW組類骨質(zhì)組織的表達(dá)明顯高于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(c)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)骨愈合的OPN免疫組化表達(dá)情況；(d)Ctrl組、AMD組及ESW組的骨缺損區(qū)OPN蛋白表達(dá)的平均光密度統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示ESW組優(yōu)于Ctrl組及AMD組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(n=5；*代表其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較的P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

骨髓MSCs自身表達(dá)SDF-1，且在體外無(wú)干涉因素條件下，MSCs有自身遷移的能力。有研究闡明，SDF-1通過(guò)自身反饋促進(jìn)自身的增殖、存活、成骨分化[10]，能夠誘導(dǎo)MSCs粘附。低能量剪切力通過(guò)增加SDF-1的分泌，以自身反饋的形式增加CXCR4的表達(dá)，從而促進(jìn)MSC的遷移；低頻率超聲與體外沖擊波對(duì)于骨折愈合作用具有相似之處，均通過(guò)促進(jìn)SDF-1的局部表達(dá)實(shí)現(xiàn)作用。而以上的ESW促進(jìn)效應(yīng)可以被CXCR4受體抑制劑AMD3100明顯抑制，如AMD組在骨缺損區(qū)域中的類骨質(zhì)形成較ESW組減少，結(jié)合本研究結(jié)果可充分說(shuō)明，SDF-1及CXCR4受體在ESW促進(jìn)骨愈合作用過(guò)程中具有重要作用。

局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是在細(xì)胞粘附、遷移及存活功能中起重要作用的信號(hào)分子[23]。FAK在骨骼生長(zhǎng)中起到機(jī)械傳導(dǎo)的作用，亦通過(guò)多種處理方式介導(dǎo)遷移的信號(hào)通路。MSCs向腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的遷移機(jī)制之一，即為SDF-1誘導(dǎo)FAK的激活。基于以上分析，ESW對(duì)MSCs粘附、遷移的促進(jìn)作用，除與SDF-1的自身分泌增加有關(guān)外，很可能亦與FAK的表達(dá)增加有關(guān)，筆者對(duì)其機(jī)制的研究還處于初步階段，有待進(jìn)一步探索證明。