李曉飛, 孫曉梅, 王文廣, 匡德宣, 陸彩霞, 仝品芬, 罕園園, 李 娜, 代解杰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心, 昆明 650118)

連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)是具細(xì)胞黏附作用的細(xì)胞免疫球蛋白超家族成員，也稱(chēng)之為JAM-1、JAM1 和F11R。JAM-A 在胚胎發(fā)育、正常組織結(jié)構(gòu)維持、炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。此外，JAM-A 還可作為病毒感染受體，是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(mammalian reovirus，MRV)建立外周感染的高親和力受體，通過(guò)依賴(lài)β1 整合素介導(dǎo)MRV內(nèi)化病毒進(jìn)入細(xì)胞[2]。JAM-A 的膜遠(yuǎn)端免疫球蛋白樣D1結(jié)構(gòu)域的同源二聚化是與MRV結(jié)合所必需[3]。

MRV 是一種雙鏈RNA 病毒，經(jīng)糞口途徑進(jìn)入胃腸道后被黏膜表面唾液酸受體(sialic acid，SA)吸附束縛，經(jīng)消化系統(tǒng)蛋白酶作用轉(zhuǎn)化成感染性亞病毒顆粒后，結(jié)合腸上皮細(xì)胞表面JAM-A受體感染腸道[4]。新生小鼠腸道微絨毛可介導(dǎo)MRV 快速感染，而成年小鼠微絨毛細(xì)胞不感染。MRV 行至小腸隱窩(特別是回腸)，被特化的濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞即一種微褶皺膜樣上皮細(xì)胞(membranous/microfold cell, M 細(xì)胞)攝取轉(zhuǎn)吞至Peyer Patches 淋巴結(jié)，被腸相關(guān)淋巴組織捕獲后穿過(guò)基底細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液，與血細(xì)胞表面JAM-A 相互作用介導(dǎo)血行傳播，在次級(jí)復(fù)制點(diǎn)穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞與組織細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致外周組織器官感染。MRV經(jīng)呼吸道進(jìn)入宿主肺部后，經(jīng)蛋白酶降解為感染性亞病毒顆粒，通過(guò)JAM-A 受體感染Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，造成閉塞型支氣管炎、間質(zhì)性肺炎等。覆蓋于支氣管相關(guān)淋巴組織的M細(xì)胞將MRV攝取并轉(zhuǎn)吞進(jìn)入肺相關(guān)淋巴組織，然后進(jìn)入血液傳播[5]。

已知M R V 的分離宿主物種包括人、鳥(niǎo)、牛、猴、羊、豬、狒狒和蝙蝠等[6]。雖然MRV在多數(shù)情況下僅引起宿主輕微癥狀，但亦有許多研究[7]報(bào)道MRV 導(dǎo)致單一宿主或動(dòng)物種群爆發(fā)呼吸道疾病、胃腸炎、膽道閉鎖、腦水腫或腦脊髓炎等疾病，因此，對(duì)MRV 感染的研究和監(jiān)視仍然是必要的。樹(shù)鼩與人類(lèi)及非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物有較高的遺傳同源性，在病毒感染和臨床前藥物開(kāi)發(fā)研究中具有獨(dú)特價(jià)值，這種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正在成為生命科學(xué)研究的有力工具[8]。先前的研究多次從樹(shù)鼩體內(nèi)分離出呼腸孤病毒[9-11]，這些研究為樹(shù)鼩可能是呼腸孤病毒易感宿主的觀點(diǎn)提供了有力證據(jù)。但迄今為止，尚無(wú)有關(guān)樹(shù)鼩JAM-A分子克隆和JAM-A作為樹(shù)鼩感染呼腸孤病毒受體的研究報(bào)道。因此，本研究采用cDNA 末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)獲得樹(shù)鼩JAM-A 全長(zhǎng)編碼序列，并對(duì)其序列和分子特征進(jìn)行分析，在樹(shù)鼩原代肺細(xì)胞水平驗(yàn)證了JAM-A作為呼腸孤病毒受體入侵樹(shù)鼩原代肺泡細(xì)胞(primary tree shrew alveolar epithelial cells,pTAECs)的作用機(jī)制，為今后應(yīng)用樹(shù)鼩建立呼腸孤病毒感染模型并研究其感染機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人工繁育的健康成年雄性樹(shù)鼩1 只，3 月齡，體質(zhì)量90～110 g，來(lái)源于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。實(shí)驗(yàn)操作在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心進(jìn)行[SYXK(滇)K2013-0001]。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)DWSP201803034)。

1.2 細(xì)胞和毒株

樹(shù)鼩pTAECs 由1～2 日齡的新生樹(shù)鼩分離培養(yǎng)獲得。細(xì)胞感染所用病毒株為本實(shí)驗(yàn)室自患病樹(shù)鼩糞便中分離純化的呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012。

1.3 試劑與儀器

TRIzol 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 試劑盒和PCR 預(yù)混液均購(gòu)自立陶宛Fermentas 公司，RACE 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech 公司，膠原酶Ⅺ C7657、神經(jīng)氨酸酶(NA)(產(chǎn)氣莢膜梭菌)和抗JAM-A抗體(ab180821)均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，抗3 型呼腸孤病毒抗體9BG5 購(gòu)自美國(guó)LSBio 公司，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG SA00003-1 購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，梯度PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司。

1.4 方法

1.4.1 組織采集和總RNA 提取 給樹(shù)鼩腹腔注射過(guò)量1%戊巴比妥鈉以麻醉后實(shí)施安死術(shù)，無(wú)菌打開(kāi)腹腔、胸腔和顱腔，取約100 mg 相關(guān)組織塊置于無(wú)菌無(wú)酶1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 試劑，放入DEPC 水處理過(guò)的鋼珠，在高通量組織研磨儀中300 Hz 研磨3 min，獲取組織勻漿。采集心臟抗凝全血200 μL。完成大腦、舌、食道、心、肺、肝、膽囊、胃、脾、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、腎、膀胱、睪丸、小腦、海馬、顳葉、額葉、頂葉、枕葉和視交叉 25 個(gè)組織和血液的總 RNA 提取，洗滌后的白色RNA 沉淀用40 μL DEPC 水溶解，用NanoDrop 1000 分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度。

1.4.2 PCR 和RACE 首先，擴(kuò)增出JAM-A 基因的中間序列。參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)配制反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA 為模板，用JAM-A 中間序列特異性引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序獲取JAM-A 的中間序列。其次，應(yīng)用RACE 技術(shù)和PCR 擴(kuò)增JAM-A 基因的3'端和5'端序列。按照J(rèn)AM-A 中間序列設(shè)計(jì)5'端序列特異性引物(GSP)和3'端GSP(表1)。參照反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 試劑盒說(shuō)明，分別合成5'RACE cDNA 和3'RACE cDNA。以5'RACE cDNA 為模板、5'端GSP 和自帶接頭引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以3'RACE cDNA 為模板、3'端GSP 和自帶接頭引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL 溴化乙錠)進(jìn)行電泳檢測(cè)，膠回收純化PCR 產(chǎn)物，克隆測(cè)序獲取JAM-A 的3'端和5' 端序列。最后，將中間序列和兩端序列進(jìn)行拼接，獲取樹(shù)鼩JAM-A 的全長(zhǎng)cDNA 序列。

表1 JAM-A 基因擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primers for the junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)JAM-A的組織表達(dá)分布 根據(jù)JAM-A 的全長(zhǎng)cDNA 序列，設(shè)計(jì)合成引物和探針(表2)，制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，參照TaKaRa 一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR 試劑盒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用1.4.1節(jié)提取的各組織總RNA，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，測(cè)定JAM-A mRNA 在樹(shù)鼩26 個(gè)組織中的基因拷貝數(shù)。

表2 JAM-A 基因定量探針及引物 Table 2 The probe and primers for quantitative detection of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.4 樹(shù)鼩JAM-A 基因序列分析 對(duì)拼接后樹(shù)鼩J AM-A 基因的c DN A 序列全長(zhǎng)進(jìn)行分析，用Unipro UGENE 軟件分析其編碼氨基酸。與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的JAM-A 基因進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA6.0 軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.5 樹(shù)鼩pTAECs培養(yǎng) 用清洗液[Hank's平衡鹽溶液(不含Mg2+、Ca2+)，添加1%雙抗，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇]清洗肺組織數(shù)次至上清液澄清。將肺剪碎成1 mm2大小的組織塊，再用清洗液清洗數(shù)次至上清液澄清，靜置10 min，去除清洗液。加入5 mL 0.125%胰蛋白酶，置于孵箱內(nèi)37 ℃消化0.5 h，每10 min 搖晃一次。加入含5%血清的DMEM 完全培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 mL 吸頭吸取肺組織塊，均勻分布于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，倒置培養(yǎng)瓶，加入5 mL 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2條件下倒置培養(yǎng)1 h。正置培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.4.6 病毒感染和抗體阻斷 從培養(yǎng)箱中取出用12 孔板培養(yǎng)的80%～90%融合的pTAECs，棄培養(yǎng)液，用PBS 洗3 次，按如下方式進(jìn)行處理：PBS 處理組，加入PBS，與細(xì)胞相互作用1 h；抗JAM-A 處理組，加入JAM-A 抗體(50 μg/mL)，與細(xì)胞相互作用1 h；NA 處理組，加入NA(50 mU/mL)，與細(xì)胞相互作用1 h；抗JAM-A 和NA 共同處理組，加入 JAM-A 抗體(50 μg/mL)與NA(50 mU/mL)，共同與細(xì)胞相互作用1 h。所有實(shí)驗(yàn)孔中，棄去與細(xì)胞表面分子相互作用的處理劑，加入MRV3/TS/2012 病毒液(滴度為106.5TCID50/mL)吸附液，4 ℃吸附1 h(每隔15 min，輕輕振搖1 次)，洗去病毒吸附液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.7 病毒抗原的免疫熒光染色 感染后細(xì)胞在37 ℃下條件孵育24 h 以完成病毒的一步生長(zhǎng)復(fù)制，立刻將單層細(xì)胞用1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定20 min，進(jìn)行病毒抗原σ 1 的免疫熒光染色，一抗為抗3 型呼腸孤病毒抗體9BG5，二抗為FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG。鏡下觀察間接免疫熒光，受感染的細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，細(xì)胞核無(wú)病毒抗原熒光。pTAECs 的每個(gè)處理孔隨機(jī)選擇3 個(gè)視野進(jìn)行熒光圖片的采集，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，進(jìn)行吸光度校正，讀取熒光面積和A 值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，處理組與PBS 組間比較采用非配對(duì) t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因片段擴(kuò)增結(jié)果

RT-PCR 擴(kuò)增出JAM-A 基因的中間序列片段如電泳圖1A 所示，RACE PCR 擴(kuò)增出JAM-A 基因的5'端和3'端基因片段如電泳圖1B 和圖1C所示。

2.2 JAM-A 基因特征

JAM-A 基因cDNA 全長(zhǎng)2 962 bp，編碼274氨基酸，其氨基酸序列與貓的JAM-A 高度相似(圖2A)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2B)顯示，樹(shù)鼩JAM-A基因序列與犬(Canis lupus familiaris)、貓(Felis catus)、牛(Bos taurus)最為相似，自然聚類(lèi)在同一分支，之后與人和獼猴(Macaca mulatta)聚類(lèi)為一支，最后與小鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)聚類(lèi)為一支，而斑馬魚(yú)(Danio rerio)則在哺乳動(dòng)物聚類(lèi)分支以外的分支。

2.3 組織表達(dá)量分布

繪制樹(shù)鼩25個(gè)組織和血液中的JAM-A相對(duì)表達(dá)量(以海馬為1)柱狀圖(圖3)。結(jié)果顯示，JAM-A廣泛表達(dá)于樹(shù)鼩的外周組織，呼吸道和消化道中表達(dá)水平較高。

2.4 阻斷JAM-A 可抑制呼腸孤病毒對(duì)pTAECs的感染

pTAECs 的病毒抗原免疫熒光染色和綠色熒光A 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖4)顯示，pTAECs 是呼腸孤病毒容納細(xì)胞，抗JAM-A 抗體(50 μg/mL)單獨(dú)作用在一定程度上抑制了呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012的吸附感染效率(P ＜0.000 1)，NA(50 mU/mL)單獨(dú)作用一定程度上抑制了MRV3/TS/2012病毒的吸附感染效率(P ＜0.000 1)；JAM-A(50 μg/mL)和NA(50 mU/mL)共同作用于pTAECs表面的JAM-A和SA 分子，可最大程度地抑制呼腸孤病毒的感染

圖1 JAM-A 基因片段電泳圖Figure 1 Electrophoresis bands of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene fragments

圖2 JAM-A氨基酸序列分析及基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(最大似然法; 步長(zhǎng): 1 000 times)Figure 2 Amino acid analysis and phylogenetic tree of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

圖3 樹(shù)鼩25個(gè)組織和血液中JAM-A mRNA 的表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of junctional adhesion molecule A (JAM-A) mRNA in 25 tissues and blood of tree shrew

圖4 阻斷JAM-A可抑制呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012對(duì)樹(shù)鼩原代肺泡細(xì)胞(pTAECs)的感染 Figure 4 Blocking of junctional adhesion molecule A (JAM-A) inhibits reovirus MRV3/TS/2012 infection of tree shrew pTAECs

(P ＜0.000 1)。

3 討論

樹(shù)鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已成為研究多種人類(lèi)疾病如抑郁癥、近視、乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染等的良好模型[12]。本課題組多次從樹(shù)鼩體內(nèi)分離到呼腸孤病毒，認(rèn)為樹(shù)鼩可能是研究呼腸孤病毒感染機(jī)制的良好模型。已知呼腸孤病毒入侵宿主細(xì)胞的受體有SA、JAM-A 和NgR1，但該病毒的致病機(jī)制和感染嗜性仍有待深入研究。研究人員已于2013 年完成了中緬樹(shù)鼩全基因組序列的注釋[12]，此研究對(duì)了解樹(shù)鼩的遺傳基礎(chǔ)具有重大意義。但以往發(fā)表的JAM-A 序列殘缺不全。本研究首次克隆JAM-A 基因的完整序列，對(duì)其分子特征進(jìn)行全面詳細(xì)的解析，為今后研究JAM-A 分子及功能奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)采用抗細(xì)胞受體法初步驗(yàn)證了JAM-A作為呼腸孤病毒入侵樹(shù)鼩細(xì)胞受體的功能。

呼腸孤病毒σ1 與靶細(xì)胞表面SA 結(jié)合，病毒顆粒在細(xì)胞表面橫向擴(kuò)散，促進(jìn)與JAM-A 高親和力結(jié)合，在低pH 微環(huán)境下依賴(lài)細(xì)胞膜上微管蛋白和Src 激酶協(xié)助內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[13-15]。本研究應(yīng)用NA 消解表面的SA，用抗JAM-A 抗體封閉細(xì)胞表面的JAM-A，在pTAECs 水平驗(yàn)證了JAM-A對(duì)呼腸孤病毒感染的介導(dǎo)作用。單獨(dú)使用抗JAM-A 抗體或NA 對(duì)細(xì)胞保護(hù)效果遠(yuǎn)低于同時(shí)阻斷JAM-A 和SA，說(shuō)明JAM-A 和SA 在介導(dǎo)呼腸孤病毒感染的功能上具有協(xié)同作用[16]。樹(shù)鼩JAM-A mRNA 主要在器官組織表達(dá)，其中肺部表達(dá)量最高，膽囊和直腸次之，在血液細(xì)胞中也有表達(dá)。樹(shù)鼩JAM-A 基因和氨基酸序列與貓相似性最高。值得注意的是，2015 年在貓科動(dòng)物果子貍體內(nèi)分離到一株Ⅲ型呼腸孤病毒[17]，鼻內(nèi)感染雌性BALB/c小鼠引起致命性的呼吸系統(tǒng)損傷，在肺組織中具有較其他組織更高的病毒滴度。Ⅲ型呼腸孤病毒在樹(shù)鼩肺部的病毒滴度可能更高，并造成對(duì)肺部的健康威脅，這是值得高度警惕的。

綜上所述，本研究首次克隆并分析了JAM-A分子的基因序列全長(zhǎng)，分析了JAM-A 的分子遺傳進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明了樹(shù)鼩較其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有更高的遺傳分類(lèi)學(xué)地位。JAM-A 在樹(shù)鼩體內(nèi)主要組織器官的受體分布為研究呼腸孤病毒感染樹(shù)鼩的靶器官親嗜性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，細(xì)胞水平抗體阻斷可抑制呼腸孤病毒感染，進(jìn)一步驗(yàn)證了JAM-A 是介導(dǎo)呼腸孤病毒感染受體。可以看出，呼腸孤病毒對(duì)樹(shù)鼩不同組織感染可依賴(lài)于不同的受體分子，體現(xiàn)了呼腸孤病毒的高度進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)性。這項(xiàng)研究為了解呼腸孤病毒和宿主之間的相互作用關(guān)系提供了基礎(chǔ)資料。