劉 琳，華海嬰

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，河南 鄭州 450002)

紫蘇醇[(S)-(-)-perillyl alcohol，POH]是一種具有防治腫瘤作用的單萜類物質(zhì)，同時具有廣譜、高效和低毒等優(yōu)點[1]。國內(nèi)報道其藥理作用主要為解熱、抗菌、和血、止痛和定喘等；國外報道其對乳腺癌、直腸癌和皮膚癌都有一定的療效，并且處于臨床研究階段，但紫蘇醇口服膠囊制劑Ⅱ期臨床試驗結(jié)果表明其有較大的胃腸刺激性，已有患者口服后因無法耐受而退出臨床研究。本課題前期已完成了靜脈注射用紫蘇醇亞微乳劑(perillyl alcohol of submicron emulsion，POH-SE)處方和工藝的優(yōu)化及其含量測定的研究[2]；POH-SE相分布和體外釋放研究結(jié)果表明該亞微乳有緩釋作用[3]。目前已有POH-SE在大鼠體內(nèi)的組織分布研究[4]，但尚未見紫蘇醇殼聚糖亞微乳劑(perillyl alcohol of chitosan submicron emulsion，POH-CSSE)和POH-SE對人乳腺癌MDA-MB-435s的研究報道。紫蘇醇溶液(perillyl alcohol，POH-SOL)是一定濃度的紫蘇醇溶解于乙醇溶液制成；POH-SE是紫蘇醇制成的乳劑；POH-CSSE在上述基礎(chǔ)中加入殼聚糖，以期提高紫蘇醇的靶向性。本研究主要探討POH-CSSE和POH-SE對人乳腺癌MDA-MB-435s細胞株體外抗腫瘤作用、細胞生長抑制作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；DG-302型酶標儀(美國BIO RAD 公司)；水平振蕩器(德國Biometra公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；EPICS XL型流式細胞儀(Becton Dickinson)；超低溫冰箱(日本Sanyo Medical Freezer)。

1.1.2 藥品與試劑：DMEM培養(yǎng)基(?？寺∩锘瘜W制品有限公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，TUNEL染色試劑盒(武漢博士德公司)二甲基亞砜(DMSO，北京化工廠)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Amresco公司進口分裝)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，POH-SE(自制，批號為20070802，規(guī)格為12.5 mg/ml)，POH-CSSE(自制，批號為20070803，規(guī)格為12.5 mg/ml)，POH-SOL(自制，批號為20070822，規(guī)格為12.5 mg/ml)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 瘤株：MDA-MB-435s細胞株(河南省動物實驗中心腫瘤室提供)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：所有實驗操作均在無菌環(huán)境下進行。MDA-MB-435s細胞株常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境的恒溫孵育箱中，培養(yǎng)期間每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，并每日于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及生長增殖情況，當細胞覆蓋率達80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化后傳代。實驗所用細胞均處于指數(shù)生長期。細胞計數(shù)方法為吸取混勻的細胞懸液用PBS稀釋10倍后鏡下計數(shù)，計算出細胞濃度，供實驗用。

1.2.2 分組：空白對照組(無紫蘇醇)；POH-SOL、POH-SE和POH-CSSE組，使其終濃度分別為50、100、200、400、600及800 μmol/L,共18個亞組，每組設4個復孔。

1.3 指標測定

1.3.1 細胞形態(tài)觀察及鑒定：細胞培養(yǎng)培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3.2 細胞生長曲線及抑制率的測定：根據(jù)相關(guān)研究方法[5-7]稍作改進，即取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞株MDA-MB-435s，以0.25%胰蛋自酶消化，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×105/ml濃度的單細胞懸液。將細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μl，共6組，每組4個復孔，5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)過夜。24 h后，6個藥物處理組為含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，空白對照組和POH-SOL組加相同容積的培養(yǎng)液，每孔200 μl，分別培養(yǎng)24、36、48、72及96 h后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μl(空白對照組除外)，繼續(xù)孵育4 h。小心移去培養(yǎng)液，藍色的甲瓚晶體溶解在100 μl的二甲基亞砜中，搖勻后，在波長570 nm處記錄每孔的吸光度，繪制細胞生長抑制曲線，計算藥組腫瘤細胞抑制率和半抑制濃度(IC50)。

1.3.3 原位末端標記法(TUNEL)：檢測細胞凋亡，按照試劑盒操作方法處理細胞，封片后，顯微鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。隨機計數(shù)200個細胞，計算凋亡率，凋亡率=(陽性細胞數(shù)/200)×100%。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期：POH作用48 h后，收集不同濃度POH-CSSE、POH-SE組的MDA-MB-435s細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液用PBS洗滌1次，細胞沉淀用預冷的70%乙醇在-20 ℃固定過夜；取固定后的細胞用PBS洗滌2次并懸浮之，加入終濃度為50 mg/L的核糖核酸酶A 36 ℃水浴30 min，再加入碘化丙啶染液800 μl至終濃度為50 mg/L，搖勻后4 ℃避光靜置30 min，200目尼龍網(wǎng)過濾。使用EPICS XL型流式細胞儀進行細胞周期分析及凋亡分析，低于G1期DNA含量細胞為凋亡細胞。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察及鑒定

正常MDA-MB-435s細胞呈梭形及不規(guī)則形，見圖1(A)。加入POH-SOL、POH-SE和POH-CSSE培養(yǎng)72 h后，細胞為單個散在分布，形態(tài)學改變?yōu)槿旧|(zhì)固縮但境界分明，胞漿濃縮，細胞外形皺折。POH-SE組、POH-CSSE組細胞呈片狀或塊狀形態(tài)、細胞腫脹破裂及細胞器結(jié)構(gòu)破壞；表明POH-SOL處理后細胞有較輕微的調(diào)亡，POH-SE處理后細胞有明顯的調(diào)亡，POH-CSSE處理后細胞的調(diào)亡最為明顯，見圖1(B、C、D)。

A.空白對照組；B.POH-SOL組；C.POH-SE組；D.POH-CSSE組

2.2 體外抗腫瘤活性

96 h后，不同濃度的POH-SOL、POH-SE和POH-CSSE對MDA-MB-435s細胞增殖的抑制作用見圖2。結(jié)果表明，POH-SE和POH-CSSE抑制細胞增殖作用明顯高于POH-SOL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨作用時間延長，相同藥物濃度(800 μmol/L)POH-SE和POH-CSSE的細胞增殖抑制作用均明顯高于POH-SOL溶液，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3；且POH-CSSE比POH-SE有更好的抑制作用。

圖2 POH-SE和POH-CSSE的劑量抑制曲線圖

圖3 POH-SE和POH-CSSE的時間抑制曲線圖

結(jié)果表明，藥物的增殖抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時間相關(guān)性，即隨著藥物作用時間的延長和濃度的提高，細胞毒性增加。相同條件下，POH-SE和POH-CSSE抑制腫瘤細胞增殖作用顯著強于POH-SOL。藥物濃度為400 μmol/L時，POH-SE和POH-CSSE組腫瘤細胞存活率分別為36.18%、32.06%；而POH-SOL對腫瘤細胞影響較小(腫瘤細胞存活率為57.84%)。藥物濃度為800 μmol/L時，POH-SE和POH-CSSE組細胞存活率僅為8.26%、5.62%，POH-SOL組仍有43.57%的細胞存活。相同藥物濃度時，24 h內(nèi)無明顯的差別；隨著孵育時間延長，抑制率由高至低依次為POH-CSSE>POH-SE>POH-SOL；96 h時，POH-SE和POH-CSSE組僅有少量的細胞存活，而POH-SOL組仍有43.57%的細胞存活。POH-SOL、POH-SE和POH-CSSE的IC50分別為1236.3、528.43和418.83 μmol/L。

2.3 TUNEL法檢測MDA-MB-435s細胞凋亡

通過TUNEL法檢測不同濃度POH-CSSE和POH-SE誘導人乳腺癌MDA-MB-435s細胞凋亡的情況，計算細胞凋亡率，結(jié)果見表1。不同濃度POH-CSSE和POH-SE均能誘導人乳腺癌MDA-MB-435s細胞凋亡，其中POH-CSSE 200、400及800 μmol/L組的凋亡率分別為40.29%、52.24%及70.25%，與POH-SE組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 POH-SE和POH-CSSE對人乳腺癌MDA-MB-435s細胞凋亡作用TUNEL檢測結(jié)果

注：與POH-SOL組比較，*P<0.05；與POH-SE組比較，**P<0.01

Note：vs.POH-SOL group,*P<0.05; vs.POH-SE group,**P<0.01

2.4 流式細胞儀定量分析細胞凋亡與生長周期

人乳腺癌MDA-MB-435s細胞經(jīng)POH-CSSE和POH-SE不同濃度處理48 h后，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，在G1期峰前出現(xiàn)1個亞二倍體峰，說明不同濃度POH-CSSE和POH-SE能引起MDA-MB-435s細胞的凋亡，其中POH-CSSE和POH-SE 800 μmol/L組的細胞凋亡率為47.62%和58.33%，POH-SOL組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時，POH-CSSE和POH-SE 800 μmol/L有效影響了細胞MDA-MB-435s的生長周期分布，G0/G1期的MDA-MB-435s細胞占比最高達到86.12%和75.16%，與POH-SOL組相比，MDA-MB-435s細胞G0/G1期的細胞明顯增多，而S期和G2/M期細胞數(shù)目減少，即POH-CSSE和POH-SE使MDA-MB-435s細胞生長阻滯在G0/G1期，從而誘導細胞凋亡發(fā)生，見表2。

表2 流式細胞術(shù)檢測POH-SE和POH-CSSE對MDA-MB-435s細胞周期分布的影響

注：與POH-SOL組比較，*P<0.05；與POH-SE組比較，**P<0.01

Note：vs.POH-SOL group,*P<0.05; vs.POH-SE group,**P<0.01

3 討論

POH-SE和POH-CSSE對MDA-MB-435s細胞體外的增殖抑制活性有明顯的時間和劑量依賴性，且在50～1 000 μmol/L范圍內(nèi)增殖抑制作用有明顯的量效關(guān)系。POH-CSSE對MDA-MB-435s細胞比POH-SE有更強的抑制作用，是因為經(jīng)修飾后的殼聚糖陽離子乳劑表面帶有更多的正電荷，當與細胞接觸后能很快與細胞表面的陰離子電荷吸附，延長了藥物的作用時間，抑制率明顯升高。

紫蘇醇作為抗腫瘤藥受到了廣泛關(guān)注和研究，目前認為其抗腫瘤活性可能來自代謝產(chǎn)物紫蘇酸和脫水紫蘇酸,其抑制腫瘤的機制也是多樣的。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的POH-CSSE和POH-SE對人乳腺癌MDA-MB-435s細胞的增殖有明顯的抑制作用，且隨劑量的增加其抑制作用增強，最大抑制率可達到75.23%；同時，POH-CSSE和POH-SE能改變MDA-MB-435s細胞的生長周期，POH-CSSE和POH-SE使MDA-MB-435s細胞生長阻滯在G0/G1期。Clark等[8]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POH能選擇性地終止Bcr/ab惡性轉(zhuǎn)化的髓系細胞有絲分裂周期，從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，認為這可能是POH抗腫瘤的機制之一。POH-CSSE比POH-SE對人乳腺癌細胞MDA-MB-435s抑制更強的原因如下，殼聚糖可能提高了亞微乳劑的靶向性；同時由于POH-CSSE在處方中加入殼聚糖，可以達到緩釋效果；還可以提高腫瘤主動靶向性。而在細胞生長周期的方面，POH-SE對乳腺癌細胞有明顯的抑制作用，且隨著其濃度的增加，抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴性，這可能與亞微乳的緩釋作用有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度POH-CSSE和POH-SE能誘導人乳腺癌MDA-MB-435s細胞凋亡，且呈一定的劑量/效應關(guān)系。

綜上所述，本研究驗證了POH-CSSE和POH-SE對人乳腺癌MDA-MB-435s細胞潛在的治療價值，有必要進行更深入的體內(nèi)藥效學研究和分子機制探討。