潘星羽，王欣雨，李紅歡，蔣建軍

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種重要的食源性致病菌，革蘭陽性，兼性厭氧桿菌，存在于水、土壤、食品中，能引起食源性疾病的暴發(fā)[1]。內(nèi)化素(internalin, Inl)家族包括InlA、InlB、InlC等，其中InlA和InlB為最早鑒定出的與細(xì)菌侵襲相關(guān)的毒力因子家族中最重要的內(nèi)化素蛋白，是最早被發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo) LM入侵宿主細(xì)胞的內(nèi)化素，為LM所特有的蛋白[2]。LM是一種胞內(nèi)寄生菌，其被認(rèn)為在 LM 穿透宿主屏障、入侵宿主細(xì)胞以及胞間傳播等過程中起到重要作用，其中InlA 為細(xì)菌穿越腸道上皮和胎盤屏障所必需[3]。除InlA 外, LM也通過InlB打開細(xì)胞信號(hào)途徑進(jìn)入細(xì)胞。

李斯特菌病與食用相關(guān)受污染的即食食品，包括熟食肉類、熟食沙拉、熱狗、生奶、軟奶酪和生蔬菜等有關(guān)。它主要影響免疫力低下的個(gè)體、孕婦和新生兒。LM在環(huán)境中無處不在，可抵抗不同的環(huán)境條件，生存能力極強(qiáng)，可在各種各樣與食品加工有關(guān)的環(huán)境中存活，如高鹽、低溫和低pH；能夠?qū)顾嵝原h(huán)境帶來的挑戰(zhàn)，例如酸性食物和胃腸道的挑戰(zhàn)，使LM成為一種適應(yīng)性很強(qiáng)的食源性病原體。LM還可以耐受高達(dá)10%的鹽濃度以及廣泛的pH值(4.0～9.6)[4]。LM能否引起食物中毒，主要取決于該菌能否成功突破機(jī)體的胃液屏障定殖于腸道上皮細(xì)胞。有研究將27株臨床菌株(16株分離自食物，11株分離自人)接種到模擬胃液和人工腸液中，研究LM的存活率，發(fā)現(xiàn)有些分離株在模擬胃液中仍能生存[5]。正常狀態(tài)下人體胃液的pH值在2以下，飯后胃液被稀釋，pH值上升至3.5。目前關(guān)于LM對酸性胃環(huán)境耐受情況的相關(guān)報(bào)道比較少[2]。鑒于此，本試驗(yàn)對LM90SB2及3株內(nèi)化素缺失株對不同pH條件及模擬酸性胃環(huán)境(pH值為1.5～3.5)的耐受性進(jìn)行研究，為LM的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估環(huán)境應(yīng)激分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

單增李斯特菌LM90SB2，分離自新疆某羊場患李斯特菌病綿羊的腦組織，血清型為4b型；內(nèi)化素基因缺失株LM90SB2ΔInlAB、 LM90SB2ΔInlA及 LM90SB2ΔInlB，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

腦心浸液培養(yǎng)基BHI購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker購自大連寶生物(TaKaRa)公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PCR Mix 購自廣州東盛生物科技有限公司；NaCl購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉及蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉購自大連博諾公司；NaOH購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；HCl購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水葡萄糖及氯化鉀購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀購自天津石英鐘廣霸州市化工分廠；胃蛋白酶購自Solarbio公司。

1.1.3 引物

在NCBI上下載LM F2365菌株(登錄號(hào)為AE017262)的全基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)溶血素(hly)基因引物，上下游臂為hly-F/hly-R，序列(5′- 3′)分別為TTCATCCATAGCACCACCAGCATC與TTCGGATAAAGTGTAGTGCCCCAG，產(chǎn)物大小1 590 bp，引物由北京華大基因公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備

菌種活化：于-80 ℃冰箱取4株受試菌的凍存液30 μL 加入至3 mL液體BHI培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min 培養(yǎng)16 h。

種子菌液的制備：將上述活化后的菌液劃線于BHI平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落至20 mL液體BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 20 h，作為種子菌液用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.2hly基因的擴(kuò)增

按照細(xì)菌 DNA 提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行4株受試菌 DNA 的提取，以該 DNA 作為模板，對hly基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×PCRmix(25 mmol/L)各5 μL，上、下游引物(25 mmol/L)0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 3 μL，總體積10 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性0.5 min，60.8 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.3 生長曲線的繪制

將LM90SB2、LM90SB2ΔInlAB、 LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB種子菌液與BHI液體培養(yǎng)基1∶100混合后，37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)。測定菌液OD600值，每隔2 h重復(fù)測定一次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件分析。

1.2.4 pH對單增李斯特菌的生長影響

4株種子菌液與液體BHI培養(yǎng)基按照1∶100的比例，分別加入到 pH值為 4，6，7和9的20 mL液體BHI培養(yǎng)基中，混勻后，37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)，每2 h用孔板酶標(biāo)測定儀測定菌液的吸光度值(OD600nm)，至12 h。每個(gè)菌株每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)定3個(gè)平行孔，該試驗(yàn)需重復(fù)2次。然后測定各 pH 條件下菌液的 OD600值，以pH為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，得到的數(shù)據(jù)繪制生長曲線。

1.2.5 模擬酸性胃環(huán)境的耐受試驗(yàn)

模擬胃液的配制[9]：8.3 g/L蛋白胨，3.5 g/L無水葡萄糖，2.05 g/L氯化鈉，0.6 g/L磷酸二氫鉀，0.11 g/L氯化鈣，0.37 g/L氯化鉀，10 g/L胃蛋白酶，將胃液高壓滅菌121 ℃ 30 min。用稀鹽酸調(diào)pH值為1.5，2.5和3.5，用0.22 μm的濾膜過濾除菌。將種子菌液按一定的體積比加到模擬胃液中，混勻，將其置于37 ℃水浴鍋中水浴，每隔1 h取一次樣，用1×PBS 梯度稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板)，直至3 h為止，該試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 hly基因的擴(kuò)增

如圖1所示，分別以LM90SB2、LM90SB2ΔInlAB、 LM90SB2ΔInlA、 LM90SB2ΔInlB基因組為模板，以hly-F/hly-R為上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為1 590 bp與預(yù)期相符的hly片段。

2.2 生長曲線的繪制

對于親本株LM90SB2和缺失株LM90SB2ΔInlAB、LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB，以測定時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，0～2 h 4株菌處于遲緩期，2～6 h處于對數(shù)生長期，6～12 h處于穩(wěn)定期，說明4株菌的生長趨勢表現(xiàn)一致。在整個(gè)生長過程中，親本株的OD600值始終略高于缺失株，且隨時(shí)間推移，3株缺失株生長低于親本株，尤其是LM90SB2ΔInlAB差異顯著(P<0.05)。說明內(nèi)化素A/B基因?qū)M90SB2的生長有一定的影響。

M. DNA Marker;1. LM90SB2;2.LM90SB2ΔInlAB;3. LM90SB2ΔInlA;4. LM90SB2ΔInlB;5.空白對照

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 親本株LM90SB2與缺失株LM90SB2ΔInlABLM90SB2ΔInlA LM90SB2ΔInlB生長曲線

2.3 不同pH值下生長情況

將LM90SB2和3株缺失株接種到不同pH的BHI培養(yǎng)基中，每2 h測定4株菌在不同pH環(huán)境中的OD600值。結(jié)果如圖3所示：LM90SB2親本株和3株缺失株在pH=4，6，7中生長曲線相似且生長趨勢無明顯區(qū)別，但親本株始終略高于缺失株；適宜生長的pH為6～7；pH=9的環(huán)境下，LM90SB2親本株和3株缺失株生長緩慢，隨時(shí)間推移，親本株生長趨勢高于缺失株，其中LM90SB2ΔInlAB差異顯著(P<0.05)。由此試驗(yàn)結(jié)果可見，內(nèi)化素A/B基因在LM90SB2抵抗堿性環(huán)境起著重要作用。

2.4 模擬酸性胃環(huán)境耐受試驗(yàn)

如表1、圖4所示，對4株菌進(jìn)行了模擬胃液耐受情況的研究：當(dāng)pH=3.5時(shí)4株菌的活菌數(shù)的存活率依次為LM90SB2>LM90SB2ΔInlA>LM90SB2ΔInlB>LM90SB2ΔInlAB，且4株菌的存活率在1 h后均呈下降趨勢，2 h后呈上升趨勢，LM90SB2存活率一直高于3株缺失株；當(dāng)pH=2.5時(shí)，4株菌的存活率均呈現(xiàn)下降趨勢，LM90SB2對模擬胃液的耐受力顯著高于LM90SB2ΔInlA 、LM90SB2ΔInlB(P<0.05)，極顯著高于LM90SB2ΔInlAB(P<0.01)；pH=1.5時(shí)，雖LM90SB2的存活率大幅度下降，但在1、2 h時(shí)分別有0.075%及0.03%的存活率，而3株缺失株的存活率為0%，由此可見內(nèi)化素A/B在抵抗人體胃酸的惡劣環(huán)境中起到一定作用。

圖3 不同pH值下親本株LM90SB2及其缺失株生長情況

表1 4株LM對模擬胃液的耐受試驗(yàn)

菌株模擬胃液pH 不同處理時(shí)間活菌數(shù)/(CFU·mL-1)0 h1 h2 h3 hLM90SB23.59×1075.8×1073.8×1074.6×1072.59×1074.15×1073.35×1071.5×1071.59×1076.75×1042.7×1040LM90SB2ΔInlAB3.57×1072.78×1071.85×1072.02×1072.57×1072×1071×1070.39×1071.57×107000LM90SB2ΔInlA3.58×1073.8×1072.8×1073.6×1072.58×1072.92×1071.9×1070.983×1071.58×107000LM90SB2ΔInlB3.58.2×1073.4×1072.3×1073.11×1072.58.2×1073.12×1072.45×1071×1071.58.2×107000

圖4 4株LM在模擬胃液中的存活率

3 討論

InlA 和 InlB 都是影響LM毒力強(qiáng)弱的重要內(nèi)化素。InlA 位于菌體表面，通過與上皮細(xì)胞的鈣黏蛋白受體相互作用，調(diào)節(jié)菌體被上皮細(xì)胞攝入的過程[6]。InlB 是細(xì)菌進(jìn)入各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞所必需的一種內(nèi)化素，使LM進(jìn)入宿主細(xì)胞[7]。研究表明InlA編碼內(nèi)在素A，介導(dǎo)單核細(xì)胞增生李斯特菌侵入人腸上皮細(xì)胞在酸存活中很重要[8]，而關(guān)于內(nèi)化素B的相關(guān)研究較少。

目前在內(nèi)化素A/B對LM模擬胃液耐受性的影響方面研究較少。陳建舜[8]對134株LM(包括56株譜系Ⅰ、65株Ⅱ與13株譜系Ⅲ)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除ⅢA-3譜系菌株外，其他菌株均具有良好的胃液存活能力。LIANOU等[9]的研究表明，血清型為4b的菌株對于鹽酸的耐受力普遍強(qiáng)于血清型為1/2a的菌株。PATCHETT等[10]對于同一株LM的研究結(jié)果表明，生長速率對LM對酸脅迫條件的敏感性具有獨(dú)立影響，進(jìn)而可能對酸性食品中LM的存活有影響。朱雅慧等[11]對4株不同來源的LM(LM440、ATCC19115、ATCC19111 和 ATCC15313)在模擬人體胃環(huán)境中的耐受性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)4 株受試菌對模擬胃液的耐受情況具有菌株特異性，同時(shí)與毒力強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性。

本試驗(yàn)在探究內(nèi)化素A/B對LM在不同pH值下生長曲線的影響結(jié)果顯示，pH值越大，LM的OD600值越小，且LM90SB2株生長曲線顯著高于LM90SB2ΔInlAB。本試驗(yàn)設(shè)定了3個(gè)酸度值(1.5，2.5和3.5)的模擬酸性胃環(huán)境進(jìn)行研究(由于人在進(jìn)食后胃液內(nèi)的酸度值通常處于1.5～ 3.5[1])。LM對模擬胃液的耐受性受到模擬胃液設(shè)定的pH值及菌株與胃液相互作用時(shí)間的影響。當(dāng)pH值越小，作用時(shí)間越長時(shí)，LM的存活率越?。簆H為3.5時(shí)4株菌在1～2 h內(nèi)的生長菌呈下降趨勢，在2 h后又出現(xiàn)上升趨勢；pH2.5時(shí)4株菌的存活率隨著時(shí)間的推移都呈下降趨勢；pH=1.5時(shí)3株缺失株的存活率都為0，LM90SB2在2h后存活率為0。由此可見生長速率越大的受試菌株對強(qiáng)堿強(qiáng)酸的抵抗力相對越強(qiáng)。綜上，本研究對內(nèi)化素A/B對LM的耐酸性影響有了進(jìn)一步的研究，對于LM感染的臨床防控、食品安全及環(huán)境應(yīng)激提供參考依據(jù)。