張忠輝，高閃電*，獨(dú)軍政，田占成，王建東，殷宏,3*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染導(dǎo)致的動(dòng)物疫病，呈世界性分布[1]。該病主要發(fā)生于牛，可出現(xiàn)高熱、腹瀉、白細(xì)胞減少、沉郁、流涎、減奶、停奶、結(jié)膜炎、口腔黏膜充血潰瘍、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎等多種臨床癥狀，還可由于持續(xù)感染導(dǎo)致免疫耐受和免疫抑制。鑒于該病導(dǎo)致的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告的牛傳染性疾病之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列為三類(lèi)動(dòng)物疫病。

BVDV在分類(lèi)學(xué)上屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)，為單股正鏈RNA病毒[2]。成熟的病毒粒子為球形，直徑40～60 nm，其核衣殼位于病毒粒子的中央，呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)雙層包裹C蛋白和病毒基因組RNA構(gòu)成。BVDV基因組全長(zhǎng)12.3～12.5 kb，只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由約4 000個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，在翻譯同時(shí)或翻譯后經(jīng)細(xì)胞和病毒基因編碼的蛋白酶加工為11或12種蛋白，其中P14(C)、gP48(Erns)、gP25(E1)、gP53(E2)4個(gè)蛋白為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其余為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。C蛋白是病毒編碼的第二個(gè)蛋白，分子質(zhì)量為14 kDa，是一種小的堿性多肽，主要功能是結(jié)合病毒基因組RNA并形成核衣殼，在保護(hù)病毒基因組RNA方面起重要作用。研究表明，同屬的豬瘟病毒C蛋白還具有參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[4]、影響病毒毒力[5-6]、拮抗病毒增殖等作用[7]。為了進(jìn)一步研究C蛋白在BVDV感染中起的重要作用，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)獲得重組C蛋白，并制備了兔源多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒株、載體、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

克隆用pGEM-T easy載體購(gòu)自Promega公司。原核表達(dá)載體pET42a(+)購(gòu)自Novagen公司。克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。表達(dá)工程菌株BL21 Rosetta (DE3) pLysS購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用病毒株BVDV-AV69 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。牛腎細(xì)胞(MDBK)細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室并保存。8周齡新西蘭白兔購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司。PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)、內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)自Solarbio公司；GST·Bind蛋白質(zhì)純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自Abcam公司。SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。兔抗 BVDV全病毒陽(yáng)性參考血清和陰性血清，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank公布的BVDV基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，F(xiàn)：5′-CATGGATCCTCCGACACAAATGCAGAAG-3′、R：5′-GACAAGCTTTCCCACTGCAACCTGAAAC-3′，用于擴(kuò)增BVDV C基因，預(yù)期片段大小為306 bp，委托西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 BVDV總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)RNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取BVDV總RNA。以提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體(50 μL)包括：Primer F：1.5 μL，Primer R：1.5 μL，Enzyme Mix：2 μL，2×1 Step Buffer：24 μL，RNA：4 μL，RNase free H2O：17 μL；PCR反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；94 ℃ min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，35 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃，1 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)鑒定。

1.2.3 基因克隆

膠回收PCR產(chǎn)物，與克隆載體pGEM-T easy于16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)克隆利用M13F/R引物進(jìn)行PCR鑒定，將初步鑒定正確的菌落用氨芐LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.4 C基因表達(dá)載體的構(gòu)建

分別將測(cè)序正確的pGEM-T easy-C和表達(dá)載體pET42a用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA Ligase連接于16 ℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)化BL21 Rosetta (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞，搖菌并提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒pET42a-C送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.5 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將篩選到的pET42a-C陽(yáng)性重組菌，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1 mM的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，6 000 r/min離心10 min，收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，功率150 W超聲時(shí)間30 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況。確定蛋白表達(dá)后，以同樣的方法誘導(dǎo)500 mL重組菌，超聲裂解后，以GST樹(shù)脂親和層析法對(duì)上清中的目的蛋白進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blot分析

將純化獲得的重組C蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別以兔抗BVDV陽(yáng)性參考血清(1∶1 000)和兔陰性血清(1∶1 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗5次，每次5 min。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶15 000)作用1 h，PBST洗5次，每次5 min，之后加入SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，利用BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.7 多克隆抗體的制備

將純化的C蛋白與弗氏完全佐劑等比例混合后乳化成油乳劑，經(jīng)腘淋巴結(jié)和背部皮下多點(diǎn)注射免疫2只雄性白兔，免疫的抗原用量為100 μg。2周后以相同抗原用量的重組C蛋白與弗氏不完全佐劑經(jīng)乳化后進(jìn)行二免。二免2周后以相同抗原進(jìn)行三免。三免結(jié)束10 d后經(jīng)心臟采血，分離血清，備用。

1.2.8 多克隆抗體的鑒定

多克隆抗體效價(jià)測(cè)定：以純化的重組C蛋白100 μL(濃度為0.5 μg/mL)包被ELISA反應(yīng)板，進(jìn)行間接ELISA對(duì)多克隆抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。將兔抗C蛋白多克隆血清、免疫前的兔陰性血清分別進(jìn)行1∶100～1∶25 600倍比稀釋?zhuān)?∶10 000倍稀釋辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，以TMB為底物顯色液，以免疫血清OD450 nm值/陰性對(duì)照血清OD450 nm值大于等于2為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)抗體反應(yīng)性：將MDBK細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔用500 TCID50的BVDV-AV69 接種，36 h后用無(wú)水乙醇固定30 min，PBS清洗后分別加入1∶200稀釋的C蛋白多克隆抗體和陽(yáng)性對(duì)照血清、兔陰性對(duì)照血清，37 ℃孵育1 h；用PBS清洗5遍后以1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃下孵育1 h。用PBS清洗5遍后，吸干并用甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察，判定多克隆抗體與BVDV天然抗原的反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 C基因RT-PCR擴(kuò)增

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，利用3 %瓊脂糖凝膠電泳后，在位于306 bp處可見(jiàn)與預(yù)期結(jié)果大小一致的擴(kuò)增條帶(圖1)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000 Marker；1. C基因

圖1 C基因RT-PCR擴(kuò)增

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

利用BamHⅠ和HindⅢ將C基因定向克隆至載體pET-42a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，獲3個(gè)陽(yáng)性克隆(圖2)，提取質(zhì)粒測(cè)序表明重組表達(dá)載體具有正確的讀碼框。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1-5. 菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6. 陽(yáng)性對(duì)照；7. 陰性對(duì)照

圖2 重組質(zhì)粒pET-42a-C的PCR鑒定

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的重組菌株，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600nm值達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG后誘導(dǎo)，8 h后收集菌體超聲波破碎菌體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，重組C蛋白以可溶形式表達(dá)，經(jīng)純化得到分子質(zhì)量約45 kDa的目的蛋白(圖3)。

2.4 重組蛋白的免疫印跡檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白可與BVDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與陰性血清未見(jiàn)反應(yīng)(圖4)。

M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)；2. 誘導(dǎo)2 h；3. 誘導(dǎo)4 h；4. 誘導(dǎo)6 h；5. 超聲后沉淀；6. 超聲后上清；7. 純化的C蛋白

圖3 重組C蛋白的表達(dá)和純化

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的蛋白與陽(yáng)性血清作用；2.純化后的蛋白與陰性血清作用

圖4 重組表達(dá)蛋白的Western blot分析

2.5 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

ELISA結(jié)果表明(圖5)，當(dāng)血清稀釋度達(dá)到25 600時(shí)，兩兔抗C蛋白多克隆抗體在OD450 nm值分別為1.592和1.611，明顯高于陰性對(duì)照兔血清的OD450 nm值，說(shuō)明成功制備了抗C蛋白多克隆抗體，其效價(jià)可以達(dá)到1∶25 600以上。

A. 抗C蛋白家兔血清; B. 抗C蛋白家兔血清; N.免疫前家兔血清

圖5 間接ELISA法測(cè)定兔C蛋白多克隆抗體的效價(jià)

2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)

MDBK細(xì)胞接種BVDV 36 h后，利用制備的多克隆抗體(圖6A)和陽(yáng)性血清(圖6B)進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，可檢測(cè)到特異的熒光，而未接種病毒的MDBK細(xì)胞中未見(jiàn)熒光信號(hào)(圖6C)，表明制備的兔抗C蛋白多克隆抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中的BVDV天然抗原具有良好的反應(yīng)原性。

A. 本研究制備的多殼隆抗體；B.陽(yáng)性參考血清對(duì)照；C.陰性血清對(duì)照

3 討論

BVDV的衣殼蛋白基因編碼102個(gè)氨基酸，在BVDV多聚蛋白加工過(guò)程中，N蛋白由于自我切割從C蛋白N端解離，之后多聚蛋白在C蛋白C端信號(hào)序列介導(dǎo)下轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)由信號(hào)肽酶進(jìn)行C蛋白和Erns蛋白的切割[8]。信號(hào)肽酶進(jìn)一步切割除去膜錨定序列后產(chǎn)生90個(gè)氨基酸組成的成熟C蛋白。成熟的C蛋白與病毒基因組結(jié)合，并由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源的蛋白形成囊膜，與Erns蛋白、E1蛋白以及E2蛋白組裝成病毒粒子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并最終通過(guò)細(xì)胞分泌途徑釋放至胞外[9]。C蛋白在瘟病毒屬比較保守，除了結(jié)合病毒基因組RNA形成核衣殼，目前發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒C蛋白還可與宿主SUMO化通路蛋白作用影響病毒毒力、與血紅蛋白β亞基相互作用拮抗病毒增殖[7]，但尚不清楚BVDV C蛋白是否具有類(lèi)似的功能。為了進(jìn)一步研究BVDV C蛋白的功能，本研究選用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了C蛋白的表達(dá)。谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)來(lái)源于日本血吸蟲(chóng)，其基因融合表達(dá)體系具有蛋白表達(dá)產(chǎn)率高、表達(dá)產(chǎn)物純化方便以及利于抗體制備等優(yōu)點(diǎn)[10]，而且該蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞并無(wú)表達(dá)，因此在純化后我們并未切除GST標(biāo)簽。前期研究發(fā)現(xiàn)，去除NADL毒株C蛋白C端13個(gè)氨基酸序列有利于其在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)，但去除C端10個(gè)氨基酸的Erns信號(hào)肽序列進(jìn)行蛋白表達(dá)并不能獲得足夠的可溶性蛋白[11]。在本研究中，表達(dá)完整的C蛋白獲得了理想的表達(dá)量，這可能由于所用毒株基因和載體不同，導(dǎo)致目的基因的表達(dá)量存在一定差異。為了獲得針對(duì)完整C蛋白的多克隆抗體，本試驗(yàn)并未去除C蛋白C端的氨基酸。免疫印跡證實(shí)純化所獲C蛋白具有良好的反應(yīng)原性，在免疫后獲得具有較高效價(jià)的兔源多克隆抗血清。由于C蛋白抗體不具中和病毒的活性，本研究采用了間接免疫熒光試驗(yàn)的方法驗(yàn)證了所獲單克隆抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒天然抗原的反應(yīng)活性。目前，BVDV的衣殼蛋白諸多的功能，包括其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、通過(guò)與宿主蛋白互作調(diào)控病毒感染等，有待于深入研究。本研究成功制備了BVDV C蛋白多克隆抗體，從而為后續(xù)C蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。