劉健，楊顯超，葛菲菲，李鑫，楊德全，沈海瀟，鞠厚斌，王建，趙洪進(jìn)

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

豬流感(swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，典型癥狀為豬突然發(fā)病，短期發(fā)熱、食欲不振、嗜睡、咳嗽、呼吸困難及鼻腔流出分泌物等[1]。SI一年四季均可發(fā)生，但以冬、春和秋季多發(fā)，不同年齡、性別和品種的豬對(duì)該病均易感染。1930年Shope首次分離鑒定了經(jīng)典H1N1亞型豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)。一般認(rèn)為人流感病毒具有宿主限制性，很少跨越種間屏障在另外的宿主群內(nèi)建立穩(wěn)定的譜系。但由于豬體內(nèi)呼吸道上皮細(xì)胞同時(shí)具有人流感病毒受體唾液酸α-2, 6半乳糖苷和禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)受體唾液酸α-2, 3半乳糖苷，因此豬既可以感染人流感病毒又可以感染AIV，被認(rèn)為是禽、豬、人等不同流感病毒基因 重配的“混合器”[2-3]。

目前在豬群中流行的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2三種亞型。其中H1N1亞型SIV主要包括經(jīng)典SIV、歐亞類禽H1N1 SIV、類人H1N1 SIV和2009 H1N1 SIV[4]。本研究從上海地區(qū)某豬場(chǎng)豬群的鼻腔中分離得到6株H1N1亞型SIV，選擇其中1株將其命名為A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)，并對(duì)分離株進(jìn)行病毒形態(tài)學(xué)、紅細(xì)胞凝集特性、部分理化特性、血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)序列測(cè)定等研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

2017年12月12日，從上海某豬場(chǎng)收集到疑似SIV癥狀豬的鼻拭子18份，冷藏，24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測(cè)

將采集的豬鼻拭子樣品經(jīng)A型流感病毒通用型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)，陽(yáng)性樣品用于病毒的分離。

1.2.2 病毒分離

將經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為A型流感病毒陽(yáng)性的豬鼻拭子樣品進(jìn)行病毒分離。鼻拭子緩沖液5 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，置-80 ℃凍存?zhèn)溆谩４齅DCK細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將處理好的病料樣品接種至細(xì)胞單層，置于37 ℃吸附1 h，換上維持液(HDMEM+2%FBS)37 ℃、5 %濃度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，凍融3次收集病毒上清液。上清液再接種10日齡SPF雞胚，尿囊腔接種0.2 mL/枚，每份樣品接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)72 h，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集剩余未死或死亡雞胚的尿囊液，并經(jīng)SPF雞胚盲傳2代。

1.2.3 病毒鑒定

血凝素凝集試驗(yàn)：對(duì)收獲的第一代細(xì)胞上清液、第二代和第三代雞胚尿囊液進(jìn)行血凝素凝集試驗(yàn)。

第六項(xiàng)工作是課程評(píng)價(jià)。在課程評(píng)價(jià)時(shí)，須注意處理好過程與結(jié)果、個(gè)人與小組、規(guī)范與創(chuàng)新、階段與整體幾對(duì)關(guān)系。

病毒電鏡觀察：將血凝陽(yáng)性的第三代病毒尿囊液液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾處理，送至華東師范大學(xué)，進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染、透射電鏡觀察其形態(tài)和大小。

HA和NA序列的測(cè)定：參照文獻(xiàn)提供的方法擴(kuò)增分離株的HA和NA片段[1]，HA節(jié)段的引物序列為：5′-AGCAAAAGCAGGGG-3′/5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′；NA節(jié)段的引物序列為：5′-AGCAAAAGCAGGAGT-3′/5′-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3′，其中HA片段大小為1 778 bp，NA片段大小為1 466 bp。將RT-PCR產(chǎn)物電泳，經(jīng)凝膠回收，按pMD 18-T載體說(shuō)明書進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆送桑尼生物有限公司測(cè)序。

HA和NA核苷酸序列同源性分析和遺傳演化分析：將HA和NA核苷酸序列經(jīng)NCBI檢索，進(jìn)行同源性分析；借助DNAStar軟件中的MegAlign程序進(jìn)行進(jìn)化分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病毒HA和NA亞型。

1.2.4 病毒特性研究

紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)：測(cè)定分離株對(duì)雞、人O型、牛、豬、兔、綿羊和馬等紅血球(10 mL/L)的凝集活性[6]。

血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)：將分離株分為9組，分裝于9個(gè)滅菌離心管中，置56 ℃水浴中分別處理0、5、15、30、60、90、120、150 min及過夜，處理后離心管迅速置于4 ℃冰箱5 min，分別測(cè)定其血凝效價(jià)[5]。血凝素?zé)岱€(wěn)定性判定方法：設(shè)定血凝活性下降2個(gè)滴度的時(shí)間為T1，當(dāng)T1≤ 5 min時(shí)為熱不穩(wěn)定型；當(dāng)T1=15 min時(shí)為中等熱穩(wěn)定型；當(dāng)T1≥ 30 min時(shí)為熱穩(wěn)定型。

耐熱性試驗(yàn)：分離株分為7個(gè)組，每組1 mL，于50 ℃水浴作用10 min、20 min、30 min和60 min，60 ℃水浴作用10 min、20 min和30 min，每個(gè)處理接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死亡雞胚的尿囊液，測(cè)定血凝效價(jià)。病毒耐熱性判定方法：設(shè)定水浴作用的時(shí)間為T2，當(dāng)T2≥30 min病毒存活，則判定為該溫度下耐熱，否則為不耐熱[5]。

乙醚敏感試驗(yàn)：取含SIV病毒的雞胚尿囊液1 mL，加入0.25 mL乙醚，4 ℃作用24 h，同時(shí)用滅菌生理鹽水代替乙醚作對(duì)照，每個(gè)處理接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死亡雞胚的尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)[5]。

氯仿敏感試驗(yàn)：取含SIV病毒的雞胚尿囊液，分為2組，每組1 mL，一組加入終濃度為48 mL/L的氯仿，4 ℃作用10 min；另一組用滅菌生理鹽水代替氯仿作對(duì)照，每個(gè)處理接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死亡雞胚的尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)[5]。

耐酸性試驗(yàn)：取含SIV病毒的雞胚尿囊液，等量分裝為2份，一份用0.1 mol/L鹽酸調(diào)至pH 3.0，室溫下作用3 h，再用56 g/L NaHCO3溶液將pH值調(diào)至7.0；另一份加入滅菌生理鹽水，同樣室溫下放置1 h，以上2份尿囊液經(jīng)10倍稀釋后，每個(gè)處理接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死亡雞胚的尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)[5]。

1.2.5 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定

病毒用PBS緩沖液10倍倍比稀釋至10-12，接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種6枚，0.2 mL/胚，37 ℃培養(yǎng)，每隔8 h照胚1次，收集24～96 h死亡或未死亡雞胚的尿囊液，分別測(cè)定血凝效價(jià)，病毒效價(jià)大于等于4 log2的尿囊液判為陽(yáng)性[8]。按Reed-Muench法[9]計(jì)算EID50。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測(cè)

經(jīng)A型流感病毒通用型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)，18份豬鼻拭子樣品中有6份為SIV陽(yáng)性。

2.2 SIV分離株血凝試驗(yàn)

將6份SIV陽(yáng)性豬鼻拭子樣品進(jìn)行病毒分離，其細(xì)胞培養(yǎng)液和雞胚尿囊液均有血凝性，選擇其中1株病毒命名為A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)，經(jīng)測(cè)試后其血凝價(jià)分別為4 log2、5 log2和5 log2。

2.3 病毒的電鏡觀察

在電子顯微鏡下A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)病毒粒子為圓形、橢圓形及多型性，直徑大小為80～120 nm(圖1)。

2.4 HA和NA序列的測(cè)定及亞型鑒定

對(duì)A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)進(jìn)行HA和NA基因的測(cè)序，將序列上傳至GenBank，登錄號(hào)分別為MG983997(HA)和MG983999(NA)。利用GenBank中的BLAST工具查找與其HA和NA基因片段開放閱讀框核苷酸序列同源性最高的毒株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離株的HA基因片段與分離自中國(guó)的A/swine/Jiangsu/49/2012(H1N1) HA基因片段(登錄號(hào)：KP404348.1)同源性最高，達(dá)到98%；NA基因片段與分離自中國(guó)的A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1) NA基因片段(登錄號(hào)：KM594558.1)同源性最高，達(dá)到97%。

將HA和NA基因的序列分別與來(lái)自GenBank的經(jīng)典型豬H1N1、類人型豬H1N1、類禽型豬H1N1和2009 H1N1分支代表毒株進(jìn)行比對(duì)，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)HA(圖2A)和NA(圖2B)基因片段均屬于類禽型豬H1N1的進(jìn)化分支。

圖1 A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)病毒的電鏡觀察

注：黑色實(shí)心三角代表分離株

2.5 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

在測(cè)試SIV分離株對(duì)7種紅細(xì)胞凝集作用的試驗(yàn)中，連續(xù)三代病毒都對(duì)雞紅細(xì)胞、人O型紅細(xì)胞和豬紅細(xì)胞有凝集作用，牛、羊、兔和馬紅細(xì)胞均無(wú)凝集作用(表1)。

表1 SIV分離株對(duì)7種紅細(xì)胞的凝集作用 log2

2.6 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)

SIV分離株在56 ℃水浴5 min，其血凝價(jià)未下降；水浴30 min后，其血凝價(jià)下降1個(gè)滴度，其血凝素為熱穩(wěn)定型(表2)。

2.7 耐熱性試驗(yàn)

對(duì)A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)進(jìn)行耐熱性鑒定，病毒在50 ℃時(shí)都表現(xiàn)為耐熱型(表3)，在60 ℃時(shí)表現(xiàn)為不耐熱型(表4)。

2.8 有機(jī)溶劑試驗(yàn)

病毒經(jīng)乙醚、氯仿和酸有機(jī)溶劑處理，接種雞胚96 h后，發(fā)現(xiàn)SIV分離株對(duì)乙醚、氯仿和酸均為敏感(見表5)。

2.9 EID50測(cè)定

將SIV分離株稀釋后分別接種雞胚，不能導(dǎo)致雞胚的死亡。經(jīng)測(cè)定，A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)第三代尿囊液的EID50為1×10-4.75/0.2 mL。

表2 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)

毒株不同時(shí)間血凝素?zé)岱€(wěn)定性/min0515306090120150過夜熱穩(wěn)定性A/swine/Shanghai/1205/2017555420000熱穩(wěn)定型

表3 50 ℃耐熱性試驗(yàn)

毒株10 min20 min30 min60 min耐熱性A/swine/Shanghai/1205/20173/33/33/33/3耐熱型

注：A/B，A表示處理后的分離株接種雞胚后其尿囊液HA陽(yáng)性數(shù)，B表示雞胚的接種數(shù)。下同

表4 60 ℃耐熱性試驗(yàn)

毒株10 min20 min30 min耐熱性A/swine/Shanghai/1205/20172/30/30/3不耐熱型

表5 經(jīng)不同方法處理后病毒對(duì)雞胚的感染率

毒株組別乙醚氯仿酸A/swine/Shanghai/1205/2017處理組0/30/30/3對(duì)照組3/33/33/3

3 討論

本研究對(duì)上海某疑似感染SIV的豬場(chǎng)豬鼻拭子樣品進(jìn)行了SIV的熒光RT-PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行了病毒分離，并分離到6株SIV，選擇其中1株將其命名為A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)。采用血凝試驗(yàn)、電鏡觀察、血凝素和神經(jīng)氨酸酶測(cè)序等方法對(duì)該分離株進(jìn)行了鑒定和病毒特性研究。分離株在常溫下對(duì)雞紅細(xì)胞、人O型紅細(xì)胞和豬紅細(xì)胞具有凝集活性，對(duì)牛、羊、兔和馬紅細(xì)胞無(wú)凝集活性，符合豬流感病毒特性[10]。A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)屬于血凝素?zé)岱€(wěn)定型，耐50 ℃高溫，但對(duì)60 ℃敏感；對(duì)乙醚、氯仿和酸敏感，一般消毒劑均能將其滅活，與已報(bào)道的豬流感病毒特性一致[11]。A/swine/Shanghai/1205/2017(H1N1)對(duì)SPF雞胚無(wú)致死性，因此認(rèn)為其對(duì)SPF雞胚為低致病性[12]。研究結(jié)果表明，上海地區(qū)豬群中存在對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)耐受性，且對(duì)雞胚低致病性的A型H1N1亞型豬流感病毒。

根據(jù)以往的SIV分離與鑒定的經(jīng)驗(yàn)，本研究將待分離樣本首先進(jìn)行MDCK細(xì)胞培養(yǎng)，再進(jìn)行SPF雞胚傳代，獲得了SIV分離株。臨床實(shí)踐中，豬群SIV感染多為一過性，且10日齡SPF雞胚購(gòu)買后還需要繼續(xù)孵化，樣本保存時(shí)間較長(zhǎng)不利于SIV的分離，使用MDCK進(jìn)行初步的培養(yǎng)有利于提高SIV分離效率。同時(shí)SIV在細(xì)胞中增殖滴度沒有在SPF雞胚中高，且病毒的血凝活性容易丟失，因此病毒的增殖和保存都在SPF雞胚中完成。本研究中SIV病毒分離方法的優(yōu)化有效地提高了病毒的分離效率，也保證了病毒的滴度，為今后SIV的分離提供了幫助。

豬被認(rèn)為是禽流感病毒(AIV)對(duì)人的適應(yīng)過程的中間宿主或是作為遺傳學(xué)上重配病毒的“混合器”[13]。因此，及時(shí)掌握我國(guó)豬群中SIV的感染情況，加強(qiáng)豬群中流感病毒的檢測(cè)，制定合理科學(xué)的防治措施，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究從上海地區(qū)的豬群中分離到類禽型A型H1N1亞型SIV，雖然進(jìn)行了初步的病毒特性研究，但是病毒是否會(huì)在豬群中持續(xù)演化和重配進(jìn)而傳染給人，以及是否會(huì)對(duì)豬造成更嚴(yán)重的致病性有待于進(jìn)一步的研究。