周 蕾，安婷婷，趙秀芹，徐冬蕾，蔣 毅，王瑞白，萬康林，楊再昌

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的傳染性疾病，是全球十大致死病因之一。耐藥結(jié)核病的增多更加重了疾病負(fù)擔(dān)[1]。2019年WHO全球結(jié)核病報(bào)告顯示全球大約有1 000萬結(jié)核病患者，死亡145萬，利福平耐藥結(jié)核病(Rifampin-resistant TB，RR-TB)患者人數(shù)約為48.4萬，其中耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)患者占78%，我國在全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中RR-TB患者數(shù)位于世界第三[2-3]。非結(jié)分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria，NTM)是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌外的分枝桿菌的總稱。由其引發(fā)的疾病逐年增加，尤其是非結(jié)和結(jié)核分枝桿菌的混合感染在耐藥結(jié)核病中占到了30%以上，加重了結(jié)核的疫情和管理難度。

獨(dú)山瓜馥木主要分布于貴州獨(dú)山、安龍等地的山林中，是黔南地區(qū)的民族藥材，在民間用藥廣泛，常用根部來活血除濕，治療風(fēng)濕和癆傷。本課題組的前期研究顯示從獨(dú)山瓜馥木提取的沒食子酸成分具有抗結(jié)核活性，并與異煙肼具有協(xié)同作用，可部分降低異煙肼的耐藥率[4]。提取的β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯，可以促進(jìn)休眠型結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇，和異煙肼聯(lián)用可以殺死休眠型結(jié)核分枝桿菌[5]。為確定從獨(dú)山瓜馥木中提取的總生物堿成分的抗結(jié)核活性及作為抗結(jié)核候選藥物進(jìn)一步研發(fā)的意義，本實(shí)驗(yàn)選取各耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌及臨床常見非結(jié)核分枝桿菌對其抗分枝桿菌活性進(jìn)行了全面的檢測和評價(jià)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用菌株 實(shí)驗(yàn)菌株來源于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核病室菌株庫。23個(gè)菌株中包括19株結(jié)核分枝桿菌和4株臨床常見非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(快生型非結(jié)分枝桿菌鳥結(jié)核分枝桿菌ATCC25291、胞內(nèi)分枝桿菌ATCC13950；慢生型非結(jié)分枝桿菌馬賽分枝桿菌DSM45103；膿腫分枝桿菌ATCC19977)。藥敏試驗(yàn)中的18個(gè)結(jié)核分枝桿菌按耐藥類型分為2株全敏菌株(含標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv)、4株異煙肼單耐藥菌株、4株利福平單耐藥菌株、4株耐多藥(Multidrug-resistant，MDR)菌株和4株泛耐藥(Extensively drug-resistant，XDR)菌株。除標(biāo)準(zhǔn)菌株外，均為我國臨床分離菌株。

1.2試劑和耗材 抗結(jié)核藥物購自美國Sigma公司；Middle brook 7H9 Agar、Mueller-Hinton Agar 和增菌液OADC購自BD公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司、Alarmar Blue 購自BIO-RAD公司；改良固體羅氏培養(yǎng)基購自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；薄層硅膠板 GF254、200-300目硅膠為中國青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、碘化鉍鉀等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1獨(dú)山瓜馥木提取物的分離制備

1.3.1.1前處理 獨(dú)山瓜馥木根采自貴州省獨(dú)山縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定。手工分揀、漂洗切塊后，自然干燥，粉碎。

1.3.1.2一次提取 10 kg原藥材，以6倍體積80%的乙醇，分批次回流提??；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(37 ℃)減壓蒸餾回收乙醇提取液，50 ℃水浴濃縮蒸干。以10%的乙醇再溶解提取物后，分別用1.5 倍體積的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷對提取物多次萃取至無色，旋蒸萃取液，得到3種一次萃取物。

1.3.1.3活性跟蹤 將一次萃取物溶解，與羅氏培養(yǎng)基混合，制備成濃度為80 μg/mL的含藥培養(yǎng)基；取3～4滴結(jié)核分枝桿菌BCG菌株(麥?zhǔn)蠞岫?.0)的新鮮培養(yǎng)物接種至含藥羅氏培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)2～3周。菌落數(shù)≤5個(gè)視為有效。

1.3.1.4二氯甲烷提取物定性分析 將萃取出的二氯甲烷層點(diǎn)板進(jìn)行薄層層析，二氯甲烷/甲醇(20/1)為展開劑展開完全后，用碘化鉍鉀顯色劑均勻噴灑薄層。

1.3.1.5二次提取 對1.3.1.2中獲得的二氯甲烷萃取物(組分1)進(jìn)行二次分離純化。200-300目硅膠柱，石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)洗脫分離生物堿類成分，得到組分2；甲醇沖洗硅膠柱，沖洗液過大孔樹脂，以50%乙醇為流動相分離苷類或者黃酮類成分，得到組分3。

1.3.2體外藥物敏感試驗(yàn)

1.3.2.1菌液制備 分枝桿菌新鮮培養(yǎng)物，超聲分散。結(jié)核分枝桿菌至麥?zhǔn)蠞岫?.0，取400 μL菌液加入7.60 mL 的7H9 (10% OADC)培養(yǎng)基中，制成8 mL菌液備用；非結(jié)分枝桿菌至麥?zhǔn)蠞岫?.5，取20 μL菌液加入7.98 mL MH (10%OADC)中，制成8 mL菌液備用(快生型非結(jié)不加OADC)。

1.3.2.2藥液制備 藥物用適宜的溶劑(水或DMSO)配制成51.2 mg/mL的儲存液，再用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基2×倍比稀釋成梯度濃度。實(shí)驗(yàn)藥物的濃度范圍為40～320 μg/mL，對照質(zhì)控藥物異煙肼和利福平為0.125～64 μg/mL，卡那霉素為1～128 μg/mL。

1.3.2.3藥敏檢測 取PCR8聯(lián)管，每孔中加入相應(yīng)備用菌液100 μL后，實(shí)驗(yàn)藥物組再加入100 μL梯度藥液，生長對照組再加入100 μL無藥物的培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)?？焐头墙Y(jié)在培養(yǎng)的第2 d，結(jié)核和慢長型非結(jié)在培養(yǎng)的第6 d開始在生長對照組的第一孔中加入70 μL Alarmar Blue顯色劑，24 h之后觀察變色情況。如顯色液從藍(lán)色變成紫紅色或粉色，說明細(xì)菌已經(jīng)生長，則在該菌株的實(shí)驗(yàn)藥物組中每孔加入70 μL顯色液。若生長孔未出現(xiàn)顏色變化，則依次每日在生長對照孔中添加顯色劑，直至變色為止。最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)定義為實(shí)驗(yàn)藥物組中顯色劑顏色完全沒有發(fā)生改變(即仍為藍(lán)色)的最小藥物濃度。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，整體藥敏試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié) 果

2.1獨(dú)山瓜馥木的提取物 10 kg原藥材經(jīng)乙醇提取后獲得600 g提取物。一次提取分別獲得80 g石油醚層、120 g乙酸乙酯層和120 g二氯甲烷層萃取物，其中二氯甲烷萃取物在活性跟蹤實(shí)驗(yàn)中的菌落數(shù)是3個(gè)，顯示其具有抗結(jié)核活性。二氯甲烷萃取物經(jīng)薄層層析和碘化鉍鉀顯色后出現(xiàn)橙紅色斑點(diǎn)，說明二氯甲烷萃取物中為總生物堿類物質(zhì)。二次提取分離，獲得9.3 g組分2和20.2 g組分3。

2.2提取物的抗結(jié)核活性 中藥相對毒性低，用量可以稍大，因此在本次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了40、80、120、160、200、240、280和320 μg/mL 8個(gè)濃度梯度。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，3種組分對非結(jié)分枝桿菌的MIC值都很高，在200 μg/mL以上，沒有很好的抑菌效果。3種組分對結(jié)核分枝桿菌的MIC值明顯低于非結(jié)分枝桿菌，都有一定程度的抑制作用，抑菌效果依次為組分2>組分1>組分3。值得注意的是，3個(gè)組分對耐藥株，無論是單藥耐藥株，還是MDR菌株的抑制效果都優(yōu)于全敏感菌株。尤其是組分2，其對43.75%(7/16)的耐藥株的MIC值低于最小檢測濃度。雖然組分3對3個(gè)菌株的MIC值為40 μg/mL，但可以看出它的抑菌效果比組分1差，因此在二氯甲烷萃取的基礎(chǔ)上進(jìn)行石油醚/乙酸乙酯萃取能進(jìn)一步提純抗結(jié)核有效成分，而50%乙醇的洗脫無效。

表1 獨(dú)山瓜馥木根提取物3個(gè)組分藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 MIC of three extracted components of Fissistigma cavaleriei root

3 討 論

結(jié)核病因?yàn)槭前麅?nèi)感染，干酪樣病灶的疏水性等原因治療困難，即使是敏感性結(jié)核病，用有效的一線藥物治療也需要6個(gè)月的療程，而利福平耐藥和耐多藥結(jié)核病不僅療程更長，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)更重(≥7 000元)，毒副作用更強(qiáng)外，治愈率僅有56%[7]。雖然當(dāng)前有23個(gè)藥物、14個(gè)候選疫苗及各種組合治療方案處于臨床試驗(yàn)階段，鑒于目前結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的全球流行形勢，對抗結(jié)核新藥的需求仍是非常迫切的。和西藥相比，中藥多采用湯劑口服的方式，較西藥的毒副作用小，療程長時(shí)病人的依從性也較好。且中藥都不是單一化合物，尤其是按照君、臣、佐、史進(jìn)行配伍使用中藥方劑，其功效也不是單一的，在抗菌的同時(shí)，還可調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能，有增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)激能力、自我修復(fù)能力和免疫力的作用，是綜合性治療。因此近年來，許多傳統(tǒng)中藥進(jìn)入了抗結(jié)核藥物研發(fā)的范疇，如苦參[6]和益母草[8]等。

獨(dú)山瓜馥木(Fissistigmacavaleriei(Lev.) Rehd.)屬于番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬(Fissistigma)攀援灌木。瓜馥木屬植物分布廣泛，全株入藥，具有祛風(fēng)活血，鎮(zhèn)痛的傳統(tǒng)功效，用于治療風(fēng)濕骨痛，手足麻木，小兒麻痹后遺癥，小兒驚風(fēng)和骨折水腫。近年的研究發(fā)現(xiàn)拓展了瓜馥木類植物的作用。研究表明瓜馥木中的內(nèi)酰胺堿可以抑制肺癌和多種實(shí)體瘤中腫瘤新生血管的增生，具有一定的抗腫瘤作用，且毒性低[9-10]。而瓜馥木中的總生物堿類以及氯仿萃取成分對香蕉炭瘟病菌(Glorospriummusαrum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、梨褐斑病菌(Mycosphaerellasentina)、黑斑病菌(Alternariakikuchiana)、芒果葉枯病菌(Pestalotiacalabae)的等數(shù)種病原菌有明顯的抑菌作用[11]。

本次研究的結(jié)果初步顯示獨(dú)山瓜馥木中除前期研究的沒食子酸和β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯外，二氯甲烷提取的總生物堿成分也具有一定的抗結(jié)核活性。在進(jìn)一步的研究中，我們將進(jìn)行總生物堿成分的結(jié)構(gòu)解析和擴(kuò)大菌株量的更系統(tǒng)的體內(nèi)外藥效評價(jià)。與β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯促進(jìn)休眠型結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇的作用不同，總生物堿成分及結(jié)合石油醚/乙酸乙酯萃取進(jìn)一步提純的組分2對單耐菌株和耐多藥菌株具有更好的抑制作用，在當(dāng)下耐藥結(jié)核病流行的嚴(yán)重形勢下，這是其明顯的優(yōu)勢。獨(dú)山瓜馥木對結(jié)核分枝桿菌敏感和耐藥菌株的作用差異也提示除已知的耐藥機(jī)制外，還有其他未闡明的遺傳因素差異在結(jié)核耐藥中起作用。獨(dú)山瓜馥木總生物堿的作用靶點(diǎn)及機(jī)制值得進(jìn)一步研究，可能會給抗結(jié)核藥物的研究提供新的靶點(diǎn)和途徑，進(jìn)而促進(jìn)全球遏止結(jié)核病計(jì)劃的實(shí)現(xiàn)。

利益沖突：無