于晶峰，桂 崢，武 琳，楊曉野，王 瑞，木 蘭

細(xì)粒棘球蚴是細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲，是和人類接觸密切、感染人類的主要寄生蟲蟲種。全球畜牧業(yè)地區(qū)和中國西部的廣大地區(qū)，是細(xì)粒棘球蚴病(包蟲病)的流行區(qū)[1-2]。隨著我國經(jīng)濟(jì)模式的改變和各省之間流動人口數(shù)量增加，先后有27個省份報道過人患包蟲病的病例，目前人感染細(xì)粒棘球蚴的病例數(shù)還在持續(xù)增加。到2018年包蟲病已被我國列為強(qiáng)制免疫的5種疾病之一。以往關(guān)于細(xì)粒棘球蚴蟲株的基因型分析和遺傳進(jìn)化特點，經(jīng)常使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶1(CO1)基因作為標(biāo)記，闡明某一地區(qū)細(xì)粒棘球蚴蟲株的所屬基因型和遺傳進(jìn)化特點。前期查閱文獻(xiàn)[3-4]發(fā)現(xiàn)線粒體氧化脫氫酶1(nad1)基因與CO1基因相比，具有較高保守性的同時，其結(jié)構(gòu)更加精簡、進(jìn)化速度更快、種間蛋白基因序列差異更大。更加適合作為人體內(nèi)寄生性絳蟲進(jìn)化分類的遺傳學(xué)標(biāo)記基因[5]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試驗樣品 本次研究中采集均來自于內(nèi)蒙古錫盟西烏旗綿羊屠宰場以及錫林浩特市醫(yī)院收治的細(xì)粒棘球蚴病患者。其中調(diào)查的羊群中包括成年和幼年綿羊，共2 313只，其中患羊數(shù)量30只，收治的細(xì)粒棘球蚴病患者均經(jīng)病理證實。所有患者均對本次研究知情同意。采用注射器(10 mL)吸出囊包中的囊液，進(jìn)行離心處理，時間為1.5 min，分離原頭蚴和囊液，置于-20 ℃環(huán)境中待檢。

1.1.2菌種、載體及主要試劑 選自天根(北京)生化科技有限公司生產(chǎn)的大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞、血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(DP304)，天根(北京)生化科技有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖膠回收試劑盒(DP209-03)，天根(北京)生化科技有限公司生產(chǎn)的pGM-T連接試劑盒(VT202-02)。選自大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的寶生物染料法熒光定量試劑盒、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素(Amp)以及大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、10×Loading Buffer。選擇北京市賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸染料以及內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)研究室提供的氫氧化鈉等常規(guī)生化試劑。

1.2基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 嚴(yán)格按照說明書要求操作，提取細(xì)粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA。根據(jù)Yang JK等[6]的相關(guān)研究中的細(xì)粒棘球蚴nad1基因的引物序列，上游引物(nad1-F):5′-GGTGGTTGTTTTTGGGTTAG-3′和下游引物(nad1-R): 5′-GTTTGCTATTGTTAATTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

目的基因擴(kuò)增以提取的細(xì)粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA為模板各組分用量: Premix Taq 40 μL，nad1-F 4 μL，nad1-R 4 μL，模板4 μL，dH2O補(bǔ)足至80 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s， 35個循環(huán)；72 ℃完全延伸10 min。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外燈下觀察結(jié)果，并采用照相系統(tǒng)對試驗結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.3擴(kuò)增片段的克隆與測序 PCR產(chǎn)物純化，嚴(yán)格按照說明書操作。采用電泳后DNA凝膠回收的純化方法。按照pGM-T載體的說明書，連接PGM-T載體與回收的PCR產(chǎn)物(見表1)。載體與目的片段的摩爾比控制在1∶3～1∶8。在20 μL連接體系中16 ℃水浴連接過夜。反應(yīng)完成后將PCR管迅速放于冰上獲得所需要的結(jié)果。

表1 連接反應(yīng)Tab.1 Connection reaction

載體和PCR產(chǎn)的連接后，轉(zhuǎn)入處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子生理狀態(tài)的微生物細(xì)胞中，感受化細(xì)胞后，過夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白色重組菌落，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，最近的一次轉(zhuǎn)化，置于2 mL LB液體培養(yǎng)基中(含有Amp)，150 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，用無菌槍頭取1 μL進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件同1.2的PCR擴(kuò)增。菌落PCR檢測重組轉(zhuǎn)化結(jié)果，陽性菌液送檢。

1.4序列分析 按照15種絳蟲線粒體nad1基因相關(guān)資料表進(jìn)行同源搜索。對序列覆蓋率、最大序列相似度、隨機(jī)匹配可能性等3個要因素進(jìn)行綜合考慮，選取圓葉目、裂頭目、原頭目等其他科屬種的nad1基因的序列，運用DNAstar 軟件計算序列間的相似性，計算不同的種群或種之間的基因差異的程度，即遺傳距離。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA4.0軟件的最大似然法和鄰接法完成，系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetic tree)進(jìn)行自居檢驗，設(shè)定循環(huán)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明nad1基因在約895 bp 處獲得了特異性條帶，與預(yù)期片段大小吻合，無非特異性的擴(kuò)增條帶(見圖1)。

M.DL-2000分子量標(biāo)記；1.西烏旗樣本；2～7.錫林浩特樣本；8.陰性對照圖1 細(xì)粒棘球蚴nad1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of nad1 gene from Echinococcus granulosus

陰影部分分別為上下游引物；M.DL-2000分子量標(biāo)記；1.西烏旗樣本；2～7.錫林浩特樣本；8.陰性對照圖2 陽性克隆菌液PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.2 Electropherogram of positive clone bacterium by PCR amplification

2.2克隆結(jié)果 陽性菌液經(jīng)PCR鑒定和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在800～1 000 bp之間出現(xiàn)了清晰的特異性條帶(見圖2)。

2.3 測序結(jié)果細(xì)粒棘球蚴nad1序列

2.3.1西烏旗羊株nad1序列 西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴以nad1-F、nad1-R為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得了nad1基因部分序列，經(jīng)處理獲得了長度為895 bp的序列，其中A的含量為19.44%，G的含量為25.92%，T的含量為46.59%，C的含量為8.04%， A的含量與T的含量相加為66.03%。

2.3.2錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴nad1序列 錫林浩特市人株測序所得的序列長度也為895 bp，其A含量為19.44%，G的含量為25.92%，T的含量為46.82%，C的含量為7.82%，其中A的含量與T的含量相加為66.26%。

2.3.3序列比對結(jié)果 本次研究結(jié)果提示，內(nèi)蒙古錫盟西烏旗羊株nad1基因序列與G1型nad1基因序列相同，而G1型nad1基因序列與錫林浩特市醫(yī)院收治的細(xì)粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列與之間存在2個變異位點，這一結(jié)果提示二者均為G1基因型。

采用ncbi Blastp對本次研究中獲得的nad1序列進(jìn)行同源分析，結(jié)果表明，內(nèi)蒙古錫盟西烏旗羊株nad1基因序列與錫林浩特市醫(yī)院收治的細(xì)粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列完全相同，基因型均為G1型。

2.3.4基因序列同源性與遺傳距離分析 內(nèi)蒙古地區(qū)羊株nad1基因序列長度均為895 bp，而人株nad1基因序列長度也為895 bp，同源性分析結(jié)果提示二者細(xì)粒棘球蚴nad1序列完全相同，且將圓葉目、帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲的nad1序列與細(xì)粒棘球蚴nad1序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果提示，相似性較高，可達(dá)到86.5%，而與圓葉目、帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲的基因差異程度很少，遺傳距離僅為0.139。與NCBI獲得的絳蟲科的的基因差異程度提示遺傳距離范圍為0.139～1.511，與肥胖帶絳蟲的基因差異程度最大，平均遺傳距離為0.8。

采用MP法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示細(xì)粒棘球蚴nad1序列與帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲、多房棘球絳蟲位于同一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹的自展值(Boostrap)均為100%(圖3、圖4)。細(xì)粒棘球蚴nad1序列所屬分支與裂頭目、裂頭科Diplogonoporus balaenopterae所屬分支相隔最遠(yuǎn)(圖3、圖4)。

圖3 基于nad1構(gòu)建的13種絳蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(MP-Maximum Parsimony法)Fig.3 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

圖4 基于nad1構(gòu)建的13種絳蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

3 討 論

細(xì)粒棘球蚴病主要見于畜牧業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū)，其感染率的高低與多種因素密切相關(guān)，如生活習(xí)慣、氣候、居住條件以及自然條件等等。細(xì)粒棘球蚴的宿主適應(yīng)性比較廣泛，其分布非常廣泛，世界各大洲牧區(qū)均可見其分布,在偶蹄類家畜以及犬動物之間循環(huán)的特點，而在我國綿羊/犬動物循環(huán)，有些寄生蟲能逃避宿主的免疫效應(yīng)，在與宿主長時間的適應(yīng)過程中發(fā)生了變異，有些寄生蟲在宿主體內(nèi)寄生蟲時,其表面抗原性發(fā)生變異,直接影響免疫識別。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，全球范圍內(nèi)將細(xì)粒棘球絳蟲劃分為10個基因型，我國主要以G1、G3、G6、G8型為主[7-8]。

細(xì)粒棘球絳蟲成蟲及其幼蟲嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展，而研究表明，細(xì)粒棘球絳蟲的蟲株的鑒定難度很大，雖然對細(xì)粒棘球絳蟲的蟲株的分化特征和形態(tài)特征可以通過生物學(xué)以及形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，但是鑒定過程中的影響因素較多，如宿主、環(huán)境等，均會影響鑒定結(jié)果，這一結(jié)果也提示基因水平上的差異并不是十分全面。進(jìn)化都是以種群為單位的,所以單個生物的DNA序列是看不出進(jìn)化信息的，由于DNA序列含有豐富的進(jìn)化信息，甚至個別物種的基因組具有多于106堿基對，穩(wěn)定性較高，組成DNA的堿基只有4種:ATCG,所以不同生物的堿基是相同的但不同生物的DNA堿基序列是不相同的[9-10]。因此，通過DNA序列進(jìn)行分析來鑒定不同種生物體、亞種及地理株是具有重要的意義的[9-11]。

我們實驗室以往的研究表明：內(nèi)蒙古兩個地區(qū)人株和羊株細(xì)粒棘球蚴CO1基因變異率均在1%以下，這種較明顯的株內(nèi)變異現(xiàn)象，與新疆、甘肅和青海地區(qū)細(xì)粒棘球蚴基因型的變異情況大體相似(楊俊克等[6]文獻(xiàn))。我們利用nad1基因作為遺傳標(biāo)記，測得細(xì)粒棘球蚴內(nèi)蒙古株的基因型也為G1型。與利用CO1基因作為標(biāo)記得出的結(jié)論一致。并且生物遺傳學(xué)結(jié)果表明：用nad1基因做標(biāo)記，序列差異大于 CO1基因種間序列差異，基于nad1基因的這一特點，可以被廣泛應(yīng)用于研究多種動物性寄生蟲的種內(nèi)和種間遺傳變異[12]。 由此可知：nad1的變異率還是比較低的，其基因較保守，基因突變一般是由于堿基的增添和缺失，但一般情況下不會發(fā)生缺失和插入，在一定程度上基因變異傾向于嘌呤被嘌呤替換或嘧啶被嘧啶替換，不是堿基對被另一個堿基對代替。本實驗也得出相同的結(jié)論，錫林郭勒盟錫林浩特市人株nad1基因序列，存在2個變異位點，為T與C轉(zhuǎn)換。樣品DNA序列里，堿基A+T含量約為66%，略高于魏玉環(huán)等[13]的報道。

本次研究中，通過對不同絳蟲nad1基因序列進(jìn)行對比，結(jié)果提示我們雖然基因序列在種內(nèi)相對保守，又存在一定的種間差異,可作為帶屬絳蟲分類鑒定。如將細(xì)粒棘球蚴與同屬帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示同源性較高，達(dá)到了86.5%，而將演化關(guān)系較為疏遠(yuǎn)的Diplogonoporus balaenopterae進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示同源性僅為75.2%。這一結(jié)果與CO1基因的進(jìn)化分析結(jié)果十分相似。CO1的基因分析結(jié)果與nad1的基因進(jìn)化分析結(jié)果均將細(xì)粒棘球蚴與加拿大棘球絳蟲化到了同一個分支，這一研究結(jié)果提示我們細(xì)粒棘球蚴與加拿大棘球絳蟲二者間發(fā)生分歧的時間較短，可能在生活習(xí)性方面還存在某些相似性。

利益沖突：無