談忠鳴，汪秀斌，周偉忠，董 晨，周 璐，洪 捷，錢慧敏，胡建利，鮑倡俊

布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布魯桿菌引起的人獸共患的傳染病，人主要通過接觸患病的牲畜或污染物感染發(fā)病。我國以羊種布魯氏菌感染為主，國外以牛種布魯氏菌為主[1]。布病可以表現(xiàn)為局部膿腫，可引起患者全身多系統(tǒng)的損害，對骨關節(jié)的損害較多。患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱(多為弛張熱)、多汗、全身乏力、關節(jié)痛和肌肉疼痛，病情嚴重時可喪失勞動能力，如不及時治療，易轉為慢性，增加治愈難度。目前發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌已有10個種(Brucellamelitensis，Brucellaabortus，Brucellasuis，Brucellaovis，Brucellaneotomae，Brucellacanis，Brucellamicroti，Brucellaceti，Brucellapinnipedialis，Brucellainopinata)[2]，感染人的布魯氏菌主要以羊種(B.melitensis)、牛種(B.abortus)及豬種(B.suis)為主[3]。

布病在全國所有省份都有病例報告，主要集中在新疆、河北、內蒙古、吉林、黑龍江、遼寧等北方地區(qū)。布病患者往往是因為接觸患病動物感染，所以由于其所從事的工作而感染情況較多，比如養(yǎng)殖廠工人、獸醫(yī)、屠宰加工人員、奶制品和皮毛加工人員等(簡稱布病職業(yè)人員)。江蘇省為布病非流行區(qū)[3]，2005年報道首例病例后，2005-2011年布病累計報告病例數開始緩慢上升，2012年后布病疫情明顯呈上升趨勢。至2014年疫情已擴散至全省所有省轄市并呈現(xiàn)逐年高發(fā)趨勢。

AMOS-PCR可以鑒別鑒別牛種、羊種及豬種布魯氏菌的多重PCR方法[4]。多位點序列分析(Multilocus sequence analysis, MLSA)是一種基于以核苷酸序列為基礎，通過對9個管家基因進行測序，比較不同樣本的等位基因多樣性。它是高通量測序技術與成熟的群體遺傳學相結合的產物，簡單易行，重復性好，可以通過國際互聯(lián)網對某一病菌株在全球范圍內的傳播情況進行追蹤監(jiān)測[5]。多位點串聯(lián)重復序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)是利用細菌基因組中不同等位基因中串聯(lián)重復序列的拷貝數多少來進行基因分型的技術。MLVA具有較高的靈敏度和特異性，并且具有快速、準確、重復性好的特點，可在全球范圍內進行實驗室數據交流與共享，用于基因分型研究及突發(fā)事件中病因的溯源，兩種方法在全球的布魯氏菌病的流行病學研究調查中起到重要的作用[6]。

為進一步預防控制江蘇省布魯氏菌的感染，本研究運用AMOS-PCR、MLSA、MLVA 3種分子分型方法對2018年收集的人間布魯氏菌進行特征分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 通過哨點醫(yī)院收集2018年全省人感染布魯氏菌菌株。分離純化菌株接種在含5%羊血平板上，注意無菌操作，四區(qū)劃線，放置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。同時對各醫(yī)院上報的布魯氏菌病患者進行流行病學資料收集。

1.2試劑與儀器 Rapid Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成，QIAamp DNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)，TaKaRa Mini Best Agarose Gel DNA Extraction Kit(寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司)。梯度PCR儀(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)、毛細管電泳儀(Qiagen, Hilden, Germany)，Applied Biosystems/HITACHI 3500xL一代測序儀(Hitachi High-technologies Corporation, Tokyo, Japan)。

1.3核酸的提取 用接種環(huán)刮取細菌加入含200 μL無菌生理鹽水的E-P管中。采用QIAamp DNA mini kit試劑盒提取DNA，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書進行，核酸-80 ℃保存待用。

1.4AMOS-PCR 根據插入序列IS711分別在牛、羊、豬3個種型的基因組中插入位置的差異，可以根據PCR擴增產物的大小來鑒別3種布魯氏菌[4]。反應體系為：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，H2O補足20 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸7 min。PCR產物經毛細管電泳分析后，直接記錄PCR產物大小。

1.5MLSA 多位點序列分析方法通過對布魯氏菌管家基因進行測序分析，研究該菌的遺傳和進化[5]。對布魯氏菌9個管家基因(gap，aroA，glk，dnaK，gyrB，trpE，cobQ，omp25及int-hyp)進行擴增，擴增條件：95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。MLSA產物用TaKaRa試劑盒回收后上機測序。

1.6MLVA 根據文獻報道[6]，對布魯氏菌的3組(panel 1、panel 2A、panel 2B)16個等位基因(panel 1：Bruce06，Bruce08,Bruce11,Bruce12，Bruce42，Bruce43，Bruce45 and Bruce55；panel 2A：Bruce18，Bruce19 and Bruce21；panel 2B：Bruce04，Bruce07，Bruce09，Bruce16 and Bruce30)進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。PCR產物經毛細管電泳分析后，記錄PCR產物大小。

1.7數據分析 測序結果用Lasergene軟件包和MEGA 4.1軟件進行編輯[7]。確定9個等位基因序號構成的基因型(Sequence Type，ST), 并用eBURST軟件與數據庫內國際參考株的ST型進行聚類分析。MLVA序列分析出每株菌16個等位基因的串聯(lián)數后，將串聯(lián)數做為字符型數據導入BioNumerics 5.1(Applied Maths, Belgium)軟件，利用非加權配伍組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)進行聚類分析。

2 結 果

2.1地區(qū)分布 通過大疫情網收集全省布病病例數據，通過致病菌識別網收集布魯氏菌株。2018年江蘇省報告病例數共175例(省內病人141例，省外病人在我省就醫(yī)的有34例)。江蘇省病例最多的5個市分別為徐州(49例)、連云港(21例)、南通(18)、南京(13例)和蘇州(11例)；全年收集菌株56株，分離最多的5個市為連云港(16株)、南通(16株)、徐州(5株)、蘇州(4株)和鹽城(4株)。

2.2AMOS-PCR 所有菌株培養(yǎng)提取核酸后進行核酸檢測，PCR產物經毛細管電泳分析后顯示，除1株菌(JS-2018-61)結果為陰性，其余均為羊種布魯氏菌(310 bp)，見圖1。

圖1 羊種布魯氏菌毛細管電泳分析圖Fig.1 Capillary electrophoresis diagram of PCR products from Brucella melitensis

2.3MLSA分型 對所有菌株進行MLSA分析，PCR產物測序后與MLSA數據庫基因序列比對，確定JS-2018-61為豬種ST17型(1-6-4-1-5-3-5-2-4)，其余均為羊種ST8型(3-2-3-2-1-5-3-8-2)。

ST8型和ST17型的9個等位基因型做為字符型數據導入eBURST軟件，并與數據庫內已有的35種ST型數據進行聚類分析，運算方法為非加權配伍組平均法(UPGMA)。聚類圖顯示ST17與ST18、ST20、ST21型聚在同一簇中，ST8型與ST7、ST9、ST10、ST11、ST12、ST34及ST35型聚在同一簇中，見圖2。

圖2 布魯氏菌全部35個ST型聚類eBURST圖Fig.2 The eBURST diagram of population snapshot by Brucella spp. 35 sequence types

2.4MLVA分析 本研究對分離到的布魯氏菌株的16個MLVA基因進行PCR擴增，毛細管電泳分析PCR產物大小(圖3)。確認所有等位基因的串聯(lián)數后，做為字符型數據BioNumerics 5.1軟件UPGMA算法進行聚類分析，見圖4。

MLVA將江蘇省2018年收集的56株布魯氏菌分離株分為47個基因亞型(46個羊種型，1個豬種型)。豬種布魯氏菌與羊種布魯氏菌存在較大差異(基因型相似度只有30%)，羊種布魯氏菌主要分為2個分支，其中一簇JS-2018-19、JS-2018-10、 JS-2018-21、JS-2018-63主要分布于連云港和徐州。另簇分離株分布于其他地區(qū)，兩分支基因型相似度為70%(14/16)。 江蘇分離株JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38為同一基因型。JS-2018-14和JS-2018-18，JS-2018-7和JS-2018-31，JS-2018-28和JS-2018-47，JS-2018-13和 JS-2018-44，JS-2018-10和JS-2018-30，JS-2018-42和 JS-2018-43分別為同一基因型，其他均為獨立的基因型。

圖3 布魯氏菌MLVA-16 PCR擴增產物毛細管電泳分析圖

圖4 2018年江蘇省布魯氏菌MLVA聚類圖Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping relationships of Brucella spp. isolates from Jiangsu Province in 2018

3 討 論

近幾年，隨著貿易的發(fā)展，布病流行越來越嚴重。江蘇省2005年開始陸續(xù)報道感染布病病例，2005-2011年布病累計報告病例數僅55例[8-10]，2012年以后江蘇省布病疫情明顯呈上升趨勢，至2014年疫情已擴散至全省所有省轄市并呈現(xiàn)逐年高發(fā)趨勢，2017年江蘇省共報告布病195例，全省報告發(fā)病率0.24/10萬，較2016年發(fā)病率上升36.97%，無死亡病例報告。

江蘇省2018年布病的流行病學特征顯示全年均可發(fā)布發(fā)病，夏季高發(fā)，冬季發(fā)病較少，夏季高發(fā)的原因可能與徐州地區(qū)的伏羊節(jié)有關。2018年全省年發(fā)病率前3的地區(qū)分別為徐州、連云港和南通，均為江蘇中北部地區(qū)。布病患者往往是因為接觸患病動物感染，因此從事相關工作的職業(yè)人群感染情況較多。江蘇省病例以男性為主，且30～70歲的農民居多[9-10]，可能與該省飼養(yǎng)牲畜主要以散養(yǎng)方式為主，多為男性在從事相關活動，養(yǎng)殖方式缺乏專業(yè)知識和規(guī)范化的管理，無防護意識增加了感染布病的風險。

根據插入序列IS711分別在牛、羊、豬3個種型的基因組中根據插入位置的差異設計的AMOS-PCR方法[11]，可同時鑒別感染人的3種布魯氏菌，并在敏感性和特異性上均高于傳統(tǒng)方法。但本研究結果顯示，豬種布魯氏菌檢測結果為陰性，說明該方法無法鑒定所有生物型的豬種布魯氏菌，存在一定的局限性。

MLSA研究發(fā)現(xiàn)江蘇省布魯氏菌病以羊種ST8型為主，與歷年相同[12-13]，但今年首次發(fā)現(xiàn)我省人感染豬種布魯氏菌ST17型，該型也是我國目前豬種布魯氏菌的主要流行ST型[14]，說明江蘇省出現(xiàn)其他種型布魯氏菌輸入的現(xiàn)象。

MLVA發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌全部為“東地中海簇”，與國內報道相同[15]。流行病學調查發(fā)現(xiàn)所有病例均為散發(fā)病例，但根據MLVA結果分析發(fā)現(xiàn)部分分離株具有相同基因型，其中JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38為同一基因型，其中JS-2018-22發(fā)現(xiàn)于泰州，JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38分離自南通，這兩個地區(qū)相鄰，JS-2018-22為待業(yè)人員，JS-2018-24和JS-2018-35 為農民，JS-2018-38在山羊市場工作，這4人存在潛在聯(lián)系。

本研究揭示了江蘇省2018年人間布魯氏菌的主要流行株的種型和基因型，為將來疫苗株的篩選生產提供了主要方向[16]，并通過MLSA和MLVA 2種分子分型技術確認了江蘇省首例人感染豬種布魯氏菌。同時也暴露出隨著經濟的發(fā)展，與之相配的制度體系不夠完善，使疫情防控更加困難，應加強牲畜檢驗檢疫及執(zhí)行力度，優(yōu)化免疫補助機制，完善撲殺補助政策。

利益沖突：無