郭珍珍, 張留君, 楚紅燕, 王鑫盛, 董家君, 王亞賓,2, 陳麗穎,2

腸球菌是人類和動物腸道重要的正常菌群，其數(shù)量僅次于大腸桿菌[1]，也是一種機會性致病菌。由于腸球菌對人和動物感染的嚴(yán)重性[2-5]以及多重耐藥的嚴(yán)峻性[6]，尋求和開發(fā)相關(guān)免疫性蛋白的新型免疫療法對腸球菌的預(yù)防治療變得尤為重要。

黏附、侵入和生物膜形成是細(xì)菌性病原體致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7-9]。生物信息學(xué)分析顯示糞腸球菌V583菌株表面毒力因子中有17種編碼細(xì)菌表面識別黏附矩陣分子(MSCRAMMs)和菌毛亞單位成分的LPXTG型細(xì)胞壁錨附蛋白[10]，而且僅有Ace、FSS1、FSS2、FSS3和EbpABC菌毛亞單位可以宿主黏附到胞外矩陣(ECM)蛋白[10-12]。進一步研究發(fā)現(xiàn)Ace和Ebp在糞腸球菌廣泛存在，且在人的心內(nèi)膜炎和尿道炎感染中起著重要的作用[13-14]，它們均有可能成為預(yù)防糞腸球菌感染的免疫原性蛋白。

糞腸球菌Ebp菌毛由ebpC基因編碼的骨架蛋白以及ebpA和ebpB基因編碼的輔助蛋白組成[15]。來自其它革蘭氏陽性菌如肺炎鏈球菌、A群鏈球菌(GBS)和B群鏈球菌的研究表明，分揀酶催化錨定的菌毛亞單位(Sortaes-Assembled Pilus subunits)，其菌毛亞單位組合能夠誘導(dǎo)出依賴補體的調(diào)理吞噬殺死抗體和免疫保護抗體，可能成為發(fā)展新的免疫治療選項[16-18]。Ebp為糞腸球菌表面菌毛，其在糞腸球菌毒力因子中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19-20]，而且由糞腸球菌引發(fā)的心內(nèi)膜炎病人血清中存在著較高滴度的抗EbpA、EbpB和EbpC抗體，證明Ebp在體內(nèi)感染中可以良好表達(dá)[10]。目前，EbpA氮末端區(qū)域(EbpANTD)和EbpC已被證明具有預(yù)防小鼠導(dǎo)尿管相關(guān)的尿路感染(CAUTIs)和大鼠心內(nèi)膜炎感染作用[21-22]，但對Ebp菌毛其他亞單位蛋白作用和動物源菌株作用尚未見報道。

本次通過生物學(xué)信息軟件對Ebp菌毛亞單位蛋白信號肽序列、胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)和抗原表位等進行預(yù)測，根據(jù)胞外區(qū)(去除信號肽區(qū)域)抗原表位預(yù)測結(jié)果，對抗原表位區(qū)域進行克隆、原核表達(dá)和純化，免疫新西蘭大白兔制備多抗，并進行了Western Blot特異性和生物膜阻斷試驗的功能性的初步驗證，以期為動物源性糞腸球菌的Ebp菌毛進行系統(tǒng)的研究和免疫預(yù)防等打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗動物和菌株 試驗用清潔級新西蘭大白兔購自河南省實驗動物中心，本試驗中所使用的糞腸球菌N9(ebpA、ebpB和ebpC陽性)、N30(ebpA、ebpB和ebpC陽性)、4-2a(ebpB、ebpC陽性)分離株與大腸桿菌 BL21均由本實驗室保存。

1.2試驗主要試劑與儀器 腦心浸出液肉湯(BHI)、溶菌酶、卡那霉素、蛋白酶抑制劑(PMSF)和Ni-Agarose填料均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；佐劑購自美國SIGMA公司；DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)、DNA膠回收試劑盒、2×SDS PAGE Sample Loading Buffe購自生工生物工程有限公司；HRP-羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。PTC-200型PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C型電泳儀，超凈化工作臺和-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，H1650-W型常溫離心機，JY98-Ⅲ型超聲波細(xì)胞粉碎機(購自上海新芝生物技術(shù)研究所)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(購自上海躍進醫(yī)療儀器廠)。

1.4目的基因的PCR擴增 根據(jù)GenBank已發(fā)表的糞腸球菌OG1RF株的EbpA(ID:CP002621)、EbpB(ID:CP002621.1)和EbpC(ID:CP002621.2)序列，由 Primer Premier 5.0軟件進行引物的設(shè)計(加粗部分為保護性堿基，下劃線部分為酶切位點)，見表1。使用生工生物工程(上海)有限公司的 Ezup 柱式基因組 DNA 抽提試劑盒(細(xì)菌)提取糞腸球菌N9株的基因組DNA，通過PCR反應(yīng)對目的基因進行擴增，總反應(yīng)體系為50 μL：2×Tap PCR Master Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA3 μL、雙蒸水30 μL。PCR程序： 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 抗原表位片段基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對目的基因進行純化回收，將回收產(chǎn)物和pET-28a分別進行雙酶切，使用T4DNA連接酶將其連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2 和 pET-28a-EF1092A(EbpB)，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，同時利用含有50 μg/mL的卡那霉素LB固體瓊脂板進行篩選，挑取單個菌落在LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。經(jīng)菌液 PCR 初步鑒定后，提取陽性菌液的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。將菌液PCR和雙酶切鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進行測序并對測序結(jié)果進行比對分析。

表1 引物序列及反應(yīng)程序Tab.1 Primer sequence and reaction program

1.6重組蛋白的原核表達(dá)及純化 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測以確定最佳誘導(dǎo)條件。將得到的菌液4℃、3 000 r/mim離心收集菌體進行超聲破碎，分別取上清和沉淀進行蛋白電泳鑒定。包涵體蛋白采用尿素純化方法純化，可溶性重組蛋白采用鎳柱純化。

1.7多克隆抗體的制備 免疫前由耳緣靜脈采血分離血清作為陰性對照。首次免疫時將蛋白與弗氏佐劑乳化完全后免疫新西蘭大白兔，間隔14 d后使用弗氏不完全佐劑，之后每間隔7 d免疫1次。免疫完成后間隔1周進行采血分離血清，采用雙向免疫擴散法檢測抗體效價，若達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，大量心臟采血制備血清，-80 ℃保存。按照常規(guī)方法進行Western Blot分析，將重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至NC膜，兔免疫血清為一抗，HRP-羊抗兔IgG作為二抗檢測抗體的特異性。

1.8抗EbpA1蛋白、EbpA3蛋白和EbpC1蛋白的多抗對糞腸球菌生物膜阻斷情況 糞腸球菌N9、N30及4-2a株于TSB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，調(diào)整菌液濃度為1.5×108CFU/mL。取200 μL上述菌液接種于TSB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，用含0.25%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，取其100 μL加入96孔板，同時每孔加入100 μL多抗，多抗的終濃度分別為1.5、0.75、0.375、0.187 5和0.093 8 mg/mL，每個梯度做6個平行，同時將含有相同數(shù)量不同菌株的糞腸球菌接種到含0.25%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基中，按照與試驗組一致的生物膜培養(yǎng)方法培養(yǎng)，但不加入制備的多抗進行阻斷此作為陰性對照，將僅加入含有0.25%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基，不加入糞腸球菌，然后與試驗組一起按生物膜培養(yǎng)方法培養(yǎng)，最后加入制備的多抗(進行阻斷)，此作為空白對照。37 ℃培養(yǎng)36 h后，PBS洗滌3次，待風(fēng)干后用甲醇固定，1%結(jié)晶紫染色15 min，蒸餾水洗滌至無色，然后加入無水乙醇溶解結(jié)晶紫，讀取570 nm處的吸光度(A)值，所有試驗均一式3份進行。

2 結(jié) 果

2.1抗原表位預(yù)測結(jié)果 在去除Ebp菌毛胞內(nèi)區(qū)和信號肽序列后，共預(yù)測了6個抗原表位，分別位于EbpA、EbpB和EbpC的N端，EbpA亞單位蛋白有3個抗原表位，氨基酸位置為1～389aa、390～755aa和751～1072aa，分別命名為EbpA1、EbpA2和EbpA3；EbpB有1個抗原表位，氨基酸位置28～438aa，命名為EbpB1；EbpC有2個抗原表位，氨基酸位置33～359aa和304～600aa，命名為EbpC1和EbpC2。

創(chuàng)新考核導(dǎo)向機制，解決“給足力”的問題。為避免“人在心不在，手到力不到”的問題，盡可能集聚起最強大的攻堅力量，強化了脫貧的考核權(quán)重，把促進貧困村經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)村貧困人口減少、農(nóng)村居民人均可支配收入等作為重要考核內(nèi)容，將鄉(xiāng)鎮(zhèn)和市直部門單位脫貧攻堅考核權(quán)重均提高至60%，并設(shè)立脫貧攻堅先進工作獎，把力量全部引導(dǎo)到脫貧攻堅上來，引導(dǎo)到真脫貧上來。

2.2抗原表位的PCR擴增 以糞腸球菌N9株的基因組DNA為模板，使用本試驗1.4的引物反應(yīng)條件和反應(yīng)體系對各抗原表位進行PCR擴增，擴增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果與預(yù)期結(jié)果大小一致，見圖1。

M為DL2000 DNA Marker; 1為ebpA1; 2為 ebpA2; 3為 ebpA3; 4為ebp B1; 5為ebp C1; 6為ebp C2; 7為Negative control圖1 基因片段PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of gene fragment

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2和pET-28a-EF1092A (EbpB)雙酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致(圖2)，即在相應(yīng)的質(zhì)粒和片段處分別出現(xiàn)了相應(yīng)的條帶，而且經(jīng)比對后序列正確。

M為DL5000 DNA Marker; 1為 pET-28a-ebpA1; 2為pET-28a-ebp A2; 3為 pET-28a-ebp A3;4為pET-28a-ebp B1; 5為pET-28a-ebp C1; 6為pET-28a-ebpC2圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of Recombinant expression plasmid through double Enzymatic digestion

2.3重組蛋白的表達(dá)及鑒定 優(yōu)化條件后，重組質(zhì)粒pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2和pET-28a-EbpB1的表達(dá)菌最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度37 ℃、IPTG終濃度0.2 mmol/L、誘導(dǎo)時間6 h。重組蛋白EbpA1和EbpA2主要以包涵體形式表達(dá)，重組蛋白EbpA3、EbpC1、EbpC2和EbpB1主要以可溶性形式表達(dá)。各重組蛋白大小分別為46.7、45.0、39.4、50.0、39.3、36.0 kD，與預(yù)期結(jié)果一致，其純化結(jié)果見圖3。

M為Marker; 1-6為Represent the recombinant protein EbpA1、EbpA2、Ebp A3、EbpB1、EbpC1、Ebp C2 respectively;7為 BL21; 8為 pET-28a empty vector is induced; 9為 pET-28a empty vector is not induced圖3 重組蛋白的鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of recombinant protein

2.4多抗效價的測定 家兔免疫重組蛋白后進行采血制備血清，采用雙向免疫擴散實驗檢測抗血清效價，結(jié)果重組蛋白EbpA1、Ebp A2、EbpA3、EbpB1、EbpC1和 EbpC2的多抗的效價分別為1∶16、1∶8、1∶32、1∶64、1∶32和1∶64，證明6個抗原表位蛋白均具有較好的特異性。

2.5Western Blot分析結(jié)果 經(jīng)原核表達(dá)并純化的EbpA1、Ebp A2、Ebp A3、Ebp B1、Ebp C1和EbpC2共6種重組蛋白經(jīng)免疫印跡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種重組蛋白均可與多抗血清進行反應(yīng)，其大小與預(yù)期結(jié)果一致，分別為46.7、45、39.4、50、39.3、36 kD，見圖4。

2.6各亞單位蛋白多抗對糞腸球菌N9、N30及4-2a株生物膜阻斷結(jié)果 糞腸球菌菌毛亞單位蛋白EbpA1、EbpA2、EbpA3、EbpB1、EbpC1、EbpC2多抗?jié)舛葘9、N30以及4-2a菌株生物膜形成影響不同，而且僅有多抗EbpA1、EbpA3和EbpC1對糞腸球菌生物膜的形成有阻斷作用，因此僅研究多抗EbpA1、EbpA3和EbpC1的生物膜形成阻斷作用。多抗EbpA1和EbpC1在濃度為0.375 mg/mL時對N9和N30菌株生物被膜形成的阻斷作用最強，多抗EbpA3在濃度為0.75 mg/mL時對N9和N30菌株生物被膜形成的阻斷作用最強，而4-2a菌株只有在多抗EbpC1濃度為0.375 mg/mL時對生物被膜形成的阻斷作用最強，與陰性組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FEbpA1-N9=6.645、FEbpA1-N30=5.089、FEbpA3-N9=3.633、FEbpA3-N30=4.441、FEbpC1-N9=4.338、FEbpC1-N30=6.149、FEbpC1-4-2a=5.880，均P<0.05)，如表2。

(a)(b)(d) M為Marker; 1為 Recombinant protein EbpA1、EbpA2、EbpB1; 2為 pET-28a empty vector is induced; 3為The recombinant plasmid was not induced;(c)(e)(f) M為Marker; 1為pET-28a empty vector is induced; 2為The recombinant plasmid was not induced; 3為Recombinant protein EbpA3、EbpC1、EbpC2圖4 各重組蛋白的免疫原性Fig.4 Immunogenicity of the recombinant proteins

3 討 論

一般來說毒力因子是預(yù)防細(xì)菌感染的良好免疫原，但在糞腸球菌眾多的公認(rèn)毒力因子中，臨床感染菌株毒力因子攜帶數(shù)量和攜帶率僅是較其它來源的的菌株較高[6]，而且，血液菌株中腸球菌毒力因子表達(dá)與致病性沒有必然的相關(guān)性[23]。目前僅有AS被作為免疫原進行了評估，而AS在人心內(nèi)膜炎和菌血癥菌株中的攜帶率僅分別為26%～52%和32%～77%[24]，在豬的臨床菌株中攜帶率僅為20.6%[6]。莢膜多糖是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分，對腸球菌的致病性起著推動作用，但聚糖在各微生物之間是不同的，并且只有與載體蛋白結(jié)合后才能起到良好的免疫作用[23]。

菌毛是許多革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖壁錨附的一種多聚蛋白結(jié)構(gòu)，由于它的致病作用和抗體的易接近性，很容易成為抗體介入的目標(biāo)[22]。Hendrickx等[25]已經(jīng)評估了革蘭氏陽性無乳鏈球菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌菌毛疫苗的有效性，而且在多個動物模型中都可以提供明顯的保護作用。腸球菌與其他革蘭氏陽性細(xì)菌菌毛具有直系同源結(jié)構(gòu)，而且，糞腸球菌Ebp菌毛在臨床分離菌株中的攜帶率超過94.59%，在屎腸球菌臨床分離菌株和環(huán)境分離菌株中的分離率也高達(dá)81.81%[26]。

表2 多抗EbpA1、EbpA3、EbpC1對糞腸球菌株生物膜生成的影響Tab.2 Effect of polyclonal antibody of EbpA1、EbpA3、EbpC1 on the biofilm information of E.faecalis strain

亞單位疫苗較傳統(tǒng)疫苗具有高安全性和高效性特點[27]。本次在ebpA、ebpB和ebpC基因共預(yù)測了6個抗原表位，其中EbpA1、EbpA3和EbpC1亞單位多抗在生物膜形成中有阻斷作用。多抗對N9、N30及4-2a菌株生物膜的不同阻斷能力可能是由于糞腸球菌Ebp表達(dá)效率不同，其表達(dá)效率在30%～72%之間[28]。本試驗中所用4-2a菌株由于缺失ebpA基因，導(dǎo)致多抗EbpA1和EbpA3對其生物膜形成的阻斷作用不明顯。Sillanp?? Jouko[21]等人觀察到ΔebpA缺失株與ΔebpABC三重缺失株的生物膜形成水平一致，而且發(fā)現(xiàn)ebpA的缺失能影響其他ebp菌毛亞單位的整體水平，進一步驗證了在生物膜形成過程中EbpA比EbpC重要，這在本試驗陰性對照中4-2a菌株生物膜形成量較N9和N30菌株低這一現(xiàn)象相一致。Flores-Mireles等[21]報道了人源糞腸球菌EbpA的氨基末端域具有免疫原性，其血清可以阻止小鼠尿道炎發(fā)生，Pinkston等[22]也報道了EbpC單克隆抗體可以保護小鼠免受心內(nèi)膜炎的干擾，其中Flores-Mireles試驗結(jié)果與我們預(yù)測的結(jié)果基本一致。

菌毛在生物膜形成、黏附及侵入均有作用，本次僅對Ebp亞單位多抗對糞腸球菌生物膜形成的阻斷作用進行驗證，下一步工作將是對Ebp亞單位多抗對包括糞腸球菌在內(nèi)的其他腸球菌的腸道細(xì)胞黏附、侵入阻斷作用以及對動物攻毒的保護作用進行實驗，以便進一步分析6個亞單位蛋白的免疫保護作用，為開發(fā)腸球菌免疫預(yù)防和治療以及血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無