楊 夢(mèng),王 鵬,袁 輝,劉曉青,徐曉倩,熊長(zhǎng)輝,黃星魁,段 然,王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica,Y.e)是一種在自然界以豬、嚙齒動(dòng)物等動(dòng)物為宿主并分布廣泛的一種人獸共患病病原菌。該菌通過被污染的食物、水，經(jīng)糞口或與動(dòng)物接觸感染，引起一系列消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和全身疾病。為了解江西地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在宿主動(dòng)物的分布和病原特征，本研究采集了2011-2016年豬咽拭子及腸內(nèi)容物，鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本，進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離培養(yǎng)及鑒定，同時(shí)對(duì)篩選出的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行血清分型、生物分型、相關(guān)毒力基因檢測(cè)及脈沖場(chǎng)凝膠電泳，為預(yù)防江西地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本 采集2011-2013年在江西省生豬屠宰場(chǎng)的生豬咽拭子202份、肛拭子100份；采集2013-2016年江西省鼠疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)的鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本各358份，其中包括2013年采集的標(biāo)本270份，2014年采集的標(biāo)本54份，2016年采集的標(biāo)本34份，2015年未采集標(biāo)本。

1.2試劑及儀器 細(xì)菌的分離培養(yǎng)選用美國(guó)BD公司的耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基(Yersinia selective ager)及其配套抗生素及英國(guó)OXOID公司的哥倫比亞營(yíng)養(yǎng)瓊脂；細(xì)菌的菌種鑒定選用法國(guó)生物梅里埃公司(bioMérieux, France)的Api 20E生化鑒定條及其配套試劑；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分型血清選用日本生研株式會(huì)社的分型血清試劑(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)；酶切、電泳及成像分別選用TaKaRa公司的NotⅠ、蛋白酶K，Cambraex Bio Science Rockland公司的瓊脂糖SeaKem Gold Agarose及美國(guó)Bio-Rad公司的CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀和GEL Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方 法

1.3.1菌株分離培養(yǎng)和鑒定 將采集生豬的咽拭子、回盲腸部位標(biāo)本及嚙齒動(dòng)物的舌根部、回盲腸部位標(biāo)本以1∶10的比例接種于改良PBS增菌液中，放至4 ℃冷增菌21 d后的增菌液上下顛倒混勻后，提取細(xì)菌DNA，利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)foxA保守基因。將PCR結(jié)果為foxA陽性的標(biāo)本接種于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌選擇性平板(CIN)，25 ℃培養(yǎng)24～48 h,挑取菌落形態(tài)疑似“公牛眼”狀(細(xì)菌的菌落中心為深紅色，外周有一環(huán)呈無色透明)的菌落, 接種于克氏雙糖斜面25 ℃培養(yǎng)24 h。挑選克氏雙糖斜面表現(xiàn)為：葡萄糖、乳糖陽性、不產(chǎn)氣、H2S陰性的菌落，接種于尿素培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基，選擇尿素酶陽性，25 ℃培養(yǎng)動(dòng)力陽性、37 ℃培養(yǎng)動(dòng)力陰性，革蘭染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌或橢圓或球桿菌細(xì)菌，用Api 20E生化板條28 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行細(xì)菌生化的鑒定。

1.3.2血清學(xué)分型 本研究采用玻片凝集法進(jìn)行血清分型(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)。選擇少量純培養(yǎng)的細(xì)菌，用生理鹽水制成細(xì)菌懸液，通過研磨分型血清觀察有無凝集顆粒形成，同時(shí)以生理鹽水自凝作為對(duì)照。

1.3.3生物分型 將純培養(yǎng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株按參考文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行生物分型。

1.3.4DNA提取及毒力基因PCR檢測(cè) 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，參照說明書步驟，從標(biāo)本增菌液中提取標(biāo)本的全基因組DNA。將鑒定分離到的79株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，進(jìn)行6種毒力基因(ystA、ystB、yadA、virF、ail和rfbc)的PCR擴(kuò)增，引物序列見參考文獻(xiàn)[2]。采用50 μL PCR體系對(duì)提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。體系如下：10×buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，dNTPs終濃度0.2 mmol/L，模板DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶(BioAsia)0.5 μL(5 u/μL)，無菌水補(bǔ)齊至50 μL。

1.3.5脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型分析 按照國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，主要參數(shù)如下：調(diào)整細(xì)菌懸液濃度至3.8-4.2 MCF；使用45 UNotI進(jìn)行酶切；電泳脈沖時(shí)間：2～20 s；電泳時(shí)間：18 h。將PFGE圖像錄入到BioNumerics(Version 5.10，Applied maths公司，比利時(shí))軟件包識(shí)別圖像條帶，用Dice系數(shù)(Dice coefficients,SD)表示每?jī)蓚€(gè)圖像之間的相似性系數(shù)。采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group average method, UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本分離結(jié)果 在2011-2016年間，本研究采集豬和鼠的標(biāo)本共1 018份，分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌79株，陽性率為7.76%(79/1 018)。

2.1.1生豬攜帶情況 2011-2013年采集豬咽拭子共202份，分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌61株，陽性率為30.20%(61/202)，采集豬肛拭子100份，分離到2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，陽性率為2.0%(2/100)。其中2011 年采集102份豬咽拭子標(biāo)本，分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌56株，陽性率為54.90%(56/102)；2013年采集100份豬咽拭子標(biāo)本，分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5株，相對(duì)應(yīng)的100份肛拭子標(biāo)本，分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌2株。見表1。

2.1.2鼠攜帶情況 2013-2016年采集鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本共716份，其中鼠盲腸部?jī)?nèi)容物標(biāo)本358份，分離到14株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，陽性率為3.91%(14/358)，鼠舌根部標(biāo)本358份，分離到2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，陽性率0.56%(2/358)。見表1。

2013年鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本共540份，其中盲腸部?jī)?nèi)容物標(biāo)本分離到7株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，舌根部標(biāo)本未分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；2014年鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本共108 份，其中盲腸部?jī)?nèi)容物標(biāo)本分離到6株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，舌根部標(biāo)本分離到2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；2016年鼠盲腸部?jī)?nèi)容物及舌根部標(biāo)本共68 份，其中盲腸部?jī)?nèi)容物標(biāo)本分離到1株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，舌根部未分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

表1 2011—2016年豬、鼠標(biāo)本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離情況Tab.1 Isolation of Yersinia enterocolitica from pigs and mice in 2011-2016

2.2菌株血清型、生物型結(jié)果 對(duì)79 株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行血清分型和生物分型，發(fā)現(xiàn)有3種血清型(O∶3、O∶5以及O∶8)及2種生物型(1A型和3型)；其中63株豬標(biāo)本分離株血清分型均為O∶3血清型，生物分型62株為生物3型，1株不能分生物型；16株鼠標(biāo)本分離株中，有3株O∶5血清型菌株，生物型全為 1A 型；有1株O∶8血清型菌株，其生物型為 1A型；未分型菌株共有12株，生物型均為1A型,見表2。

2.3菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)79株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的6個(gè)基因(ystA、ystB、ail、yadA、rfbc、virF)進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示,在63株O∶3血清型菌株中，59株攜帶ystA、yadA、virF、ail、rfbc基因，4株攜帶ystA、ail、rfbc基因；有12株攜帶ystB基因，其他的4株菌均為陰性,見表2。

表2 79株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型、生物型和毒力基因型別及檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Serotypes, biotypes and virulence genotypes and distribution of 79 strains of Yersinia enterocolitica

2.4 PFGE分型結(jié)果

2.4.1致病性菌株P(guān)FGE分型結(jié)果 使用NotI內(nèi)切酶對(duì)O∶3血清型的63株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行酶切，并進(jìn)行PFGE分型分析。結(jié)果顯示，帶型相似系數(shù)為90%～100%，可分為K6GN11-C30021、K6GN11C30012、K6GN11C30098、K6GN11-C30061、K6GN11C300100、K6GN11C30059 6種帶型，以 K6GN11C30021為主要型別，占所有菌株的80.95%(51/63)。見圖1A。

2.4.2非致病性菌株P(guān)FGE分型結(jié)果 使用NotI內(nèi)切酶對(duì)1A生物分型的16株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行酶切，并進(jìn)行PFGE分型，結(jié)果表示，帶型相似系數(shù)在70%～100%，可分為15種PFGE帶型。見圖1B。

3 討 論

通過對(duì)1 018份豬、嚙齒動(dòng)物宿主標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，總檢出率為7.76%(79/1 018)，初步了解江西省以生豬、嚙齒動(dòng)物為宿主的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢出情況。生豬、嚙齒動(dòng)物檢出率分別為20.86%(63/302)、2.24%(16/716)，提示生豬可能為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要宿主，與國(guó)內(nèi)外監(jiān)測(cè)結(jié)果一致[3]。豬咽拭子的檢出率為30.20%(61/202),豬肛拭子的陽性率為2.0%(2/100)，這一結(jié)果表示，豬的扁桃體帶菌率可能高于豬的回盲部?jī)?nèi)容物帶菌率。

不同宿主動(dòng)物的分離株的血清型和生物型差異較大。在生豬標(biāo)本中，63株分離株均為致病性O(shè)∶3血清型，其中有62株是生物3型，有1株不能分生物型；在鼠標(biāo)本中，16株為非致病性血清型O∶5、O∶8和某些未分型菌株，以1A型生物型為主。據(jù)此分析，對(duì)于存在不同血清型和生物型的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，動(dòng)物的易感性不同：豬對(duì)致病性菌株的易感性較高，而嚙齒動(dòng)物對(duì)非致病性菌株的易感性較高。

毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，目前被認(rèn)為是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌位于染色體上的重要毒力基因ystA在63株O∶3血清型菌株中均可檢測(cè)到，其與菌株的致病性相關(guān)。本次監(jiān)測(cè)中帶有ystA基因的菌株主要來源于生豬，提示生豬可能在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行、傳播與致病中起到重要作用。而16株生物1A型的菌株中，除12株攜帶ystB基因外，其他毒力基因檢測(cè)均為陰性。一般認(rèn)為，生物1A型為非致病性菌株，而攜帶ystB基因的生物1A型菌株與人類腹瀉有顯著的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，可能對(duì)人類健康構(gòu)成危害[4-5]。由此提示，應(yīng)該提高對(duì)嚙齒動(dòng)物中非致病性生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的警惕性，防范其對(duì)該區(qū)域居民造成健康危害。

A

BA為63株O∶3血清型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖 B為16株生物l A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖Fig.1 PFGE cluster tree of Yersinia enterocolitica strains

近年來，PFGE作為分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，穩(wěn)定性好、敏感性高，被廣泛用于菌株的遺傳關(guān)系的研究中[6-7]。63株血清型為O∶3型的致病性菌株可分為6個(gè)帶型，以K6GN11C30021為主要類型，聚類相似性較高，優(yōu)勢(shì)型顯著，占80.95%(51/63)。K6GN11C30021這種帶型與河南、江蘇、寧夏回族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)、青海和四川分離株的帶型一致，與北京、天津和云南分離株帶型不一樣(K6GN11C30012)。與致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分型特點(diǎn)存在差異的是，16株生物1A型的非致病性菌株可分為15種PFGE帶型，其總體聚類相似性比較低，遺傳一致性不高，個(gè)體間的帶型差異較大，呈現(xiàn)多元化流行趨勢(shì)。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌作為一種在自然界以多種動(dòng)物為宿主并分布廣泛的人獸共患病病原菌，已發(fā)現(xiàn)有30多種動(dòng)物攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[8]。其宿主生豬，尤其是豬咽拭子中，分離率較高[9]。本研究中生豬咽拭子分離結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，生豬可能是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的某些致病性菌株的主要宿主,這大大增加了豬養(yǎng)殖和加工的從業(yè)人群的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)生豬中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的監(jiān)測(cè)，降低其在豬體內(nèi)的的感染風(fēng)險(xiǎn)，控制小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的傳播。

利益沖突：無