馬 英，魯 亮，龔正達(dá)，李華昌，楊貴榮，劉起勇

哺乳動(dòng)物是動(dòng)物類(lèi)群中分類(lèi)學(xué)和物種多樣性研究非常深入的類(lèi)群[1]，近20年來(lái)分子系統(tǒng)學(xué)的研究依然揭示著該類(lèi)群中存在大量被形態(tài)學(xué)研究忽視的種類(lèi)[2]。小型獸類(lèi)一般指兔形目的鼠兔屬、嚙齒目、勞亞食蟲(chóng)目和翼手目等小型哺乳動(dòng)物，其中翼手目以外的類(lèi)群統(tǒng)稱(chēng)為非飛行小型獸類(lèi)(Nonvolant small mammals)。非飛行小型獸類(lèi)在各種生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的功能，如參與植物種子擴(kuò)散、草場(chǎng)土壤更新等重要的生態(tài)環(huán)節(jié)[3-4]。在食物鏈中，小型獸類(lèi)作為初級(jí)消費(fèi)者，為上層的捕食動(dòng)物提供了大量的食物，是食物鏈的重要組成部分[5]。因此，小型獸類(lèi)的生物多樣性具有重要的生態(tài)學(xué)意義。同時(shí)，小型獸類(lèi)在許多人獸共患病的保存和傳播過(guò)程中都具有重要意義，從而會(huì)影響生態(tài)系統(tǒng)中人群的健康[6]。相關(guān)研究表明，小型獸類(lèi)傳播病原體與當(dāng)?shù)匦⌒瞳F類(lèi)的生物多樣性水平相關(guān)[7-10]。

目前，我國(guó)記錄的非飛行小型獸類(lèi)的數(shù)量有350種[11]。通常在宿主動(dòng)物多樣性和動(dòng)物流行病學(xué)的調(diào)查取樣中，小型獸類(lèi)種類(lèi)的準(zhǔn)確鑒定主要依賴(lài)專(zhuān)業(yè)的形態(tài)分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家。但現(xiàn)在大量的動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查中往往沒(méi)有分類(lèi)專(zhuān)家的實(shí)時(shí)參與，鑒定的準(zhǔn)確性容易出現(xiàn)問(wèn)題。而且，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)確定的小型獸類(lèi)種類(lèi)中存在很多形態(tài)差異很小的隱存種[12-13]，這增加了鑒定的難度。DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是本世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)利用DNA序列進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)[14]。通過(guò)十多年的數(shù)據(jù)積累和各類(lèi)群的研究，該技術(shù)被證明在鑒別許多動(dòng)物類(lèi)群中是可行的，包括各類(lèi)群小型獸類(lèi)中也是如此[15-20]。因此，我們可以利用DNA條形碼技術(shù)協(xié)助開(kāi)展系統(tǒng)的小型獸類(lèi)生物多樣性研究。

云南南部從上世紀(jì)80年代開(kāi)始出現(xiàn)大范圍的家鼠鼠疫疫情，涉及到臨滄市的部分縣區(qū)[21]。為了掌握當(dāng)?shù)厥笠咚拗鲃?dòng)物的構(gòu)成，尤其是自然環(huán)境中各種非飛行小型獸類(lèi)種類(lèi)的構(gòu)成，以便在鼠疫動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查中能夠有明確的宿主動(dòng)物分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)，能更好地分析各種野生鼠類(lèi)在鼠疫動(dòng)物間流行過(guò)程中的作用，我們開(kāi)展了臨滄大雪山自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)中非飛行小型獸類(lèi)的多樣性調(diào)查。為了能夠更好闡明當(dāng)?shù)胤秋w行小型獸類(lèi)物種多樣性特征，我們?cè)趹?yīng)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)的基礎(chǔ)上，利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)所獲標(biāo)本進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。

1 材料與方法

1.1研究區(qū)域概況 臨滄大雪山自然保護(hù)區(qū)位于臨滄市臨翔區(qū)和云縣交界處，東靠瀾滄江，地理坐標(biāo)：東經(jīng)99°40′34″～100°22′01″，北緯23°17′52′～24°57′28″之間。南坡位于臨翔區(qū)境內(nèi)，北坡為云縣地域。最高峰海拔3 429 m，因冬季有積雪，被當(dāng)?shù)胤Q(chēng)為大雪山。整個(gè)保護(hù)區(qū)處于橫斷山區(qū)怒山山脈南段的高山縱谷地帶，最高峰與瀾滄江的相對(duì)高程2 600 m左右，形成了豐富的自然景觀，植被的垂直分布非常明顯。1 800～2 000 m范圍內(nèi)為季風(fēng)常綠闊葉林帶、2 000～2 600 m之間為中山濕性常綠闊葉林帶、2 600～3 000 m之間為針闊葉混交林帶、3 000～3 400 m之間為蒼山冷杉林帶和亞高山灌叢草甸帶[22]。

1.2 方 法

1.2.1調(diào)查時(shí)間和范圍 調(diào)查工作從2008年11月22日開(kāi)始，至12月6日結(jié)束。在海拔1 200～3 200 m之間按照每200 m海拔進(jìn)行一次調(diào)查的原則進(jìn)行了14個(gè)點(diǎn)的調(diào)查。每天布放360個(gè)左右的鼠夾，第2 d上午檢查捕獲情況。調(diào)查點(diǎn)及其經(jīng)緯度和海拔高度見(jiàn)表1。

表1 采集點(diǎn)經(jīng)緯度和海拔以及布夾和捕獲情況Tab.1 Location and altitude of trap sites, trap number and number of captures for each locations

1.2.2非飛行小型獸類(lèi)種類(lèi)鑒定 現(xiàn)場(chǎng)捕獲的非飛行小型獸類(lèi)標(biāo)本首先根據(jù)外部形態(tài)特征進(jìn)行初步的分類(lèi)。然后選擇皮張和頭骨沒(méi)有破損、發(fā)育成熟及形態(tài)有代表性的個(gè)體制作成假剝制標(biāo)本，再根據(jù)頭骨形態(tài)和牙齒形態(tài)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定。嚙齒目標(biāo)本形態(tài)鑒定的依據(jù)是《中國(guó)嚙齒類(lèi)》[23]，其他小型獸類(lèi)的形態(tài)鑒定參考《中國(guó)獸類(lèi)野外手冊(cè)》[24]。

1.2.3 DNA條形碼鑒定

1.2.3.1組織樣品的保存 現(xiàn)場(chǎng)采集標(biāo)本取肌肉組織用95%酒精浸泡保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后低溫冷凍保存。提取肌肉組織的總DNA時(shí)，使用QIAGEN DNeasy Kit(凱杰生物技術(shù)有限公司，上海)，根據(jù)試劑盒的使用方法提取DNA，并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2線(xiàn)粒體基因組細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COI)基因片段的PCR擴(kuò)增 在25 mL反應(yīng)體系中，10×Buffer 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DNA模板1 μL，LATaqDNA聚合酶(寶生物工程有限公司，大連) 0.75 U。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)。其中引物首先采用BatL5310和R6036R[25]，在不能擴(kuò)增的情況下，選擇雞尾酒引物VF1LFt1和VR1LRt1[26]進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3.3DNA條形碼的序列分析 首先用Chromos軟件觀察測(cè)序峰圖質(zhì)量，如果峰圖質(zhì)量很差不能準(zhǔn)確判斷堿基，則重新進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。拼接后的測(cè)序結(jié)果用Clustal X[27]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖止ふ{(diào)整。同時(shí)將測(cè)定的序列在NCBI上運(yùn)行BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較，以確保所獲得的序列是目標(biāo)序列，排除擴(kuò)增得到假基因序列的可能。根據(jù)BLAST結(jié)果，將相似度大于98%的序列作為參考序列用于系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建及小型獸類(lèi)的鑒定。對(duì)于GenBank中沒(méi)有近緣序列的個(gè)體，首先依據(jù)形態(tài)特征定種；對(duì)于難以用形態(tài)特征確定種類(lèi)的食蟲(chóng)類(lèi)小型獸類(lèi)，將頭骨照片和序列提交給中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所的何鍇博士進(jìn)行鑒定。所有小型獸類(lèi)中文名和學(xué)名參照“中國(guó)哺乳動(dòng)物多樣性編目(第2版)”[11]。最后運(yùn)用Mega6[28]軟件基于Kimura-2-parameter (K2P)[29]模型計(jì)算各物種的遺傳距離。采用鄰接法構(gòu)建全部COI基因序列的NJ系統(tǒng)樹(shù)，對(duì)NJ樹(shù)進(jìn)行內(nèi)部分支檢驗(yàn)與1 000次Bootstrap檢驗(yàn)分析，來(lái)確定各支系的BS置信度。

1.2.3.4利用DNA條形碼進(jìn)行樣品鑒定 使用DNA條形碼進(jìn)行標(biāo)本鑒定遵從2個(gè)原則, 一是序列是否與已知物種的序列構(gòu)成單系[30]，二是遺傳差異在一定的范圍之內(nèi)。真獸亞綱哺乳動(dòng)物COI基因的條形碼區(qū)域種間平均遺傳距離約為7.39%(K2P距離)[31]，因此對(duì)于用于DNA條形碼的COI基因，本研究選用8%作為界定不同物種的標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)測(cè)得序列與參考序列構(gòu)成單系，且單系的BS值大于等于0.95時(shí)認(rèn)為二者為同一物種，當(dāng)測(cè)得序列與參考序列不構(gòu)成單系時(shí)，則認(rèn)為并非同一物種。若遺傳距離中等(85%～92%)，或測(cè)得序列與GenBank中幾個(gè)不同物種序列相似度相同時(shí)，認(rèn)為該標(biāo)本的分子鑒定只能精確到屬，但不能確定到種。

2 結(jié) 果

2.1小型獸類(lèi)捕獲情況 在各種生境中，共捕獲各種非飛行小型獸類(lèi)177只。其中，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定確定其中131只屬于嚙齒目、勞亞食蟲(chóng)目的17個(gè)物種，無(wú)法明確到種的有嚙齒目白腹鼠屬和勞亞食蟲(chóng)目個(gè)體計(jì)46只(見(jiàn)表2)。制作的憑證標(biāo)本中，白腹鼠屬的標(biāo)本暫時(shí)保存在中科院動(dòng)物所標(biāo)本館，其他標(biāo)本保存在臨滄市疾病預(yù)防控制中心。

2.2測(cè)序結(jié)果和系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建 由于中國(guó)鼩猬捕獲數(shù)量較多，所以只擴(kuò)增了其中4個(gè)樣品的COI基因。通過(guò)兩套引物的擴(kuò)增，從152份樣品中共成功擴(kuò)增并測(cè)序了121份樣品(表2)，擴(kuò)增和測(cè)序成功率為79.6%。擴(kuò)增片段的有效長(zhǎng)度在650 bp左右，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)片段的插入或缺失，證明擴(kuò)增的片段確實(shí)為線(xiàn)粒體基因組的COI基因片段。所得序列都提交GenBank共享，各種對(duì)應(yīng)的注冊(cè)號(hào)見(jiàn)表2。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，發(fā)現(xiàn)這些序列形成了25個(gè)有效的分支，多個(gè)個(gè)體構(gòu)成的分支都有100%的BS支持度(圖1)。其中，嚙齒目的鼠類(lèi)共17種，分屬鼠科、田鼠科和松鼠科；勞亞食蟲(chóng)目中的猬科2種，鼩鼱科6種。

根據(jù)系統(tǒng)樹(shù)的分支，可以發(fā)現(xiàn)臨滄大雪山地區(qū)白腹鼠屬的種類(lèi)應(yīng)該有6種，而不是根據(jù)形態(tài)特征鑒定的2～3種，說(shuō)明白腹鼠屬中存在形態(tài)學(xué)的隱存種。此外，勞亞食蟲(chóng)目的大量標(biāo)本無(wú)法用形態(tài)特征予以準(zhǔn)確鑒別，通過(guò)系統(tǒng)樹(shù)可以確定存在6個(gè)種。

3 討 論

3.1鼠科的隱存種問(wèn)題 嚙齒目鼠科是分類(lèi)學(xué)研究比較深入的一個(gè)小型獸類(lèi)類(lèi)群，但即使這樣，還有許多種類(lèi)的分類(lèi)地位存在爭(zhēng)議，鑒定特征不明確，同時(shí)一些類(lèi)群中存在隱種。在臨滄大雪山地區(qū)的嚙齒動(dòng)物中，白腹鼠屬的分類(lèi)問(wèn)題顯得尤其突出。在白腹鼠屬的傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)中，被毛中是否有刺毛是分類(lèi)的重要特征[23,32]。但在臨滄大雪山高海拔生境中捕獲的白腹鼠標(biāo)本往往都沒(méi)有刺毛，因此，區(qū)分安氏白腹鼠和北社鼠有一定的難度。同時(shí)由于地處中國(guó)和東南亞交界處，原本記錄在東南亞的白腹鼠(N.niviventer)在該地區(qū)也有分布[13,33]，因此更增加了形態(tài)分類(lèi)的難度。

表2 捕獲標(biāo)本的形態(tài)分類(lèi)、分子鑒定結(jié)果和數(shù)量及相關(guān)信息Tab.2 Information of morphologic classification, identification with DNA barcoding, number and other related data

括號(hào)中為作為參考序列的GenBank注冊(cè)號(hào)，每個(gè)物種分支節(jié)點(diǎn)的自舉檢驗(yàn)(BS)值標(biāo)注在節(jié)點(diǎn)上方。圖1 基于COI 基因片段的臨滄大雪山小型獸類(lèi)Neighbor-Joining系統(tǒng)樹(shù)Fig. The Neighbor-Joining phylogenetic tree of small mammals of Lincang mountain based on data of COI gene fragment.

在我國(guó)現(xiàn)有白腹鼠屬描述的種類(lèi)中，被毛顏色鮮艷呈棕紅色調(diào)，背部硬刺毛發(fā)達(dá)的種類(lèi)只有針毛鼠一種[23,34]，但通過(guò)DNA條形碼技術(shù)和分子系統(tǒng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)具備上述特征的白腹鼠屬的種類(lèi)不少于3種[13]。在臨滄大雪山的生態(tài)環(huán)境中，這3種都存在，只是在海拔分布上存在一定的差異。這種現(xiàn)象說(shuō)明，白腹鼠屬中存在明顯的隱存種現(xiàn)象，該屬的物種多樣性被遠(yuǎn)遠(yuǎn)低估了。

3.2不同生境中小型獸類(lèi)的物種多樣性變化 臨滄大雪山不同海拔的植被類(lèi)型大體可以分為季風(fēng)常綠闊葉林帶(1 800～2 000 m)、中山濕性常綠闊葉林帶(2 000～2 600 m)、針闊葉混交林帶(2 600～3 000 m)、蒼山冷杉林帶(3 000～3 400 m)和亞高山灌叢草甸帶，其中2 600 m以下為北亞熱帶，2 600 m以上為南溫帶[22]。在2 000 m以下地勢(shì)較緩的區(qū)域，往往是農(nóng)耕區(qū)；2 000～2 400 m為退耕還林區(qū)域，多為經(jīng)濟(jì)林；2 400 m以上則成為保護(hù)區(qū)管轄區(qū)域，人類(lèi)活動(dòng)和干擾較少。

在臨滄大雪山3 000 m以上的冷杉林帶和亞高山灌叢中，捕獲率為2.45%，主要為瀾滄江姬鼠、昭通絨鼠、安氏白腹鼠和大長(zhǎng)尾鼩等4種。在2 600～3 000 m之間的針闊葉混交林生境中，捕獲率為4.63%，小型獸類(lèi)種類(lèi)按捕獲數(shù)量排序有中國(guó)鼩猬、瀾滄江姬鼠、北社鼠、安氏白腹鼠、側(cè)紋巖松鼠、珀氏長(zhǎng)吻松鼠和多種鼩鼱類(lèi)等13種，包括筆尾樹(shù)鼠和攀鼠等稀有種類(lèi)。在2 000～2 600 m的常綠闊葉林生境中，捕獲率為2.64%，包括中國(guó)鼩猬、北社鼠、針毛鼠、白腹鼠未定種、大絨鼠、黑緣齒鼠、瀾滄江姬鼠和鼩鼱類(lèi)等11種。在2 000 m以下的生境中，農(nóng)田較多，捕獲率達(dá)到5.25%，捕獲小型獸類(lèi)包括黑緣齒鼠、黃胸鼠、灰麝鼩、毛猬、短尾鼩、大絨鼠、白腹鼠未定種和擬刺毛鼠等11種，其中與人類(lèi)活動(dòng)關(guān)系密切的小型獸類(lèi)有兩種大鼠屬種類(lèi)?？梢钥闯?，海拔2 000～3 000 m的生境中，小型獸類(lèi)的物種多樣性是最高的。該結(jié)果與其他山地多樣性調(diào)查的結(jié)果一致，說(shuō)明在山地環(huán)境中，中海拔生境是物種多樣性最為豐富的生境。

3.3不同小型獸類(lèi)種類(lèi)的海拔分布 根據(jù)不同小型獸類(lèi)種類(lèi)的采集記錄，可以發(fā)現(xiàn)這些小型獸類(lèi)在臨滄大雪山的海拔分布范圍基本與其在我國(guó)的緯度分布基本是對(duì)應(yīng)的。以白腹鼠屬的種類(lèi)為例[13]，安氏白腹鼠(N.andersoni)分布在我國(guó)青藏高原東緣一直到秦嶺的高海拔地區(qū)，相應(yīng)的，在臨滄大雪山該種也分布在較高海拔(2 500～3 200 m)。北社鼠(N.confucianus)在青藏高原東南緣沿大巴山、秦嶺、太行山一直分布到華北地區(qū)[16]，在臨滄大雪山則分布在安氏白腹鼠分布范圍的下緣。針毛鼠(N.fulvescens)基本分布于我國(guó)華南、西南南部地區(qū)，而在臨滄大雪山則分布在2 300～2 500 m之間的生境中，白腹鼠(N.niviventer)的分布一般認(rèn)為在東南亞地區(qū)，在臨滄大雪山則分布于較低海拔的生境中(1 700～2 650 m)。臨滄大雪山捕獲的鼩鼱科種類(lèi)也都是東洋界物種[35]。這些種類(lèi)在大雪山的分布基本也在2 650 m海拔以下地區(qū)，和白腹鼠屬東洋界種類(lèi)的海拔分布有相似之處。

(致謝：感謝臨滄市疾病預(yù)防控制中心的其他工作人員在現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中的工作，感謝臨滄大雪山自然保護(hù)區(qū)的兩位護(hù)林員在現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中予以的熱心幫助。感謝中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所的何鍇博士在食蟲(chóng)類(lèi)小型獸類(lèi)的分子鑒定給予的幫助。)

利益沖突：無(wú)

本文引用格式：馬英，魯亮，龔正達(dá)，等.云南臨滄大雪山自然保護(hù)區(qū)非飛行小型獸類(lèi)物種多樣性調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020,36(7)：572-577，582. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.051