徐建敏，侯水平，張 晶，陶 霞，白志軍，吳新偉，周 勇

大腸埃希菌是臨床和社區(qū)感染最常見的機(jī)會(huì)致病菌，同時(shí)其耐藥性問題也越來越突出。中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道2005-2014年各監(jiān)測(cè)醫(yī)院分離大腸埃希菌對(duì)頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥率顯著提升[1]。大腸埃希菌對(duì)頭孢類抗生素的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生超廣譜beta內(nèi)酰胺酶(ESBL)，在我國ESBL最常見的型別是CTX-M型[2]。

除了人，動(dòng)物也是產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的重要儲(chǔ)存宿主。養(yǎng)殖動(dòng)物檢出產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的比率往往比人更高[3]。近年來野生動(dòng)物檢出ESBL大腸埃希菌也越來越受到關(guān)注，人社區(qū)周邊的野生動(dòng)物受人類活動(dòng)影響易從人類排放的污水、丟棄的垃圾以及醫(yī)療廢物等獲得人的耐藥菌[4-5]。鼠形動(dòng)物是一大類外形相似、習(xí)性相近多個(gè)種類哺乳綱動(dòng)物的統(tǒng)稱，包括一些嚙齒目和食蟲目動(dòng)物，其分布廣，數(shù)量眾多。部分鼠形動(dòng)物如嚙齒目鼠科的家鼠和食蟲目鼩鼱科的鼩鼱等習(xí)慣棲息于人的住房和各類建筑物中或周圍，與人類共處于同一生活環(huán)境，接觸頻繁，是多種人獸共患的傳染性細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染的傳染源。社區(qū)環(huán)境中的鼠形動(dòng)物可以通過直接接觸人群或間接接觸食物、水源、污水管道等途徑傳播耐藥性細(xì)菌和耐藥基因。但國內(nèi)對(duì)于鼠形動(dòng)物攜帶ESBL大腸埃希菌的耐藥機(jī)制研究較少，本文擬對(duì)廣州某居民生活區(qū)捕獲的鼠形動(dòng)物腸道的ESBL大腸埃希菌進(jìn)行鑒定，分析鼠形動(dòng)物腸道ESBL大腸埃希菌的耐藥機(jī)制并對(duì)菌株進(jìn)行分子分型。

1 材料與方法

1.1樣本收集 2016年9-11月，選擇廣州市城區(qū)內(nèi)某居民區(qū)捕鼠。鼠籠布置地點(diǎn)為建筑物墻邊、下水道、垃圾桶、水溝等地點(diǎn)；以“晚放晨收”形式每月捕鼠1次，連續(xù)捕鼠3個(gè)月。對(duì)捕獲老鼠麻醉后處死，然后解剖鼠取腸道標(biāo)本。

1.2材料與儀器 Viteck2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；EC增菌肉湯購自O(shè)XID公司；SSI腸道分離平板為丹麥SSI產(chǎn)品；革蘭陰性菌鑒定卡以及革蘭陰性菌藥敏分析卡購自法國生物梅里埃公司；頭孢噻肟購自Sigma公司；PCR引物以及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海美吉生物科技公司完成。

1.3培養(yǎng)與分離 將腸內(nèi)容物樣本加入含4 μg/mL頭孢噻肟的EC增菌肉湯30 mL中培養(yǎng)18～24 h，然后接種至含4 μg/mL頭孢噻肟的SSI腸道分離平板培養(yǎng)18～24 h。從SSI腸道平板上挑取紅色的單個(gè)菌落到血平板上培養(yǎng)后再使用Viteck 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。

1.4藥敏實(shí)驗(yàn) 選擇AST-GN04革蘭陰性菌藥敏分析卡在Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定儀上對(duì)分離菌株進(jìn)行抗生素敏感性分析，AST-GN04卡包含以下抗生素：青霉素類(氨芐西林、哌拉西林)；頭孢類(頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶)；單環(huán)-β內(nèi)酰胺類(氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)；氨基糖苷類(慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星)；喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)和碳青霉烯類(亞胺培南)共14種抗生素。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603、大腸埃希菌ATCC35218和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.5超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)表型確認(rèn) 經(jīng)Vitek 2 compack藥敏實(shí)驗(yàn)鑒定為可疑產(chǎn)ESBL菌落，按照美國CLSI 2016中推薦的產(chǎn)ESBL表型確認(rèn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用雙紙片協(xié)同法，按CLSI要求進(jìn)行，判定標(biāo)準(zhǔn)按2016版CLSI標(biāo)準(zhǔn)：頭孢噻肟-頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶-頭孢他啶/克拉維酸2對(duì)紙片中的任一對(duì)，含克拉維酸和不含克拉維酸紙片之間抑菌圈差≥5 mm即為陽性。

1.6ESBL耐藥基因檢測(cè) 對(duì)于blaCTX-M基因，先使用多重PCR檢測(cè)blaCTX-M的5個(gè)亞群，再針對(duì)每個(gè)亞群使用單重PCR檢測(cè)其全片段，然后送測(cè)序，結(jié)果通過Blast比對(duì)分析其具體blaCTX-M基因亞型[6]。OXA、SHV和TEM基因的引物和擴(kuò)增參照文獻(xiàn)進(jìn)行[7-8]。

1.7多序列位點(diǎn)MLST分型 在MLST官網(wǎng)上http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli獲取針對(duì)大腸埃希菌7個(gè)管家基因的引物序列和PCR擴(kuò)增條件，7個(gè)管家基因包括：adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA，PCR產(chǎn)物測(cè)序后將序列片段在官網(wǎng)上提交并獲得相應(yīng)的ST型[9]。

1.8脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE分型 參照國際食源性致病菌病原細(xì)菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò) (PulseNet) 中非O157 PFGE分型的標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行。使用沙門菌H9812作為分子量Marker和質(zhì)控菌。使用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(50 U)，37 ℃酶切 2 h；電泳參數(shù)為6.76～35.38 s, 18 h；用BioNumerics 7.6軟件對(duì)基因圖譜進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖譜。

2 結(jié) 果

2.1鼠形動(dòng)物監(jiān)測(cè)結(jié)果 2016年9～11月期間，連續(xù)捕鼠3個(gè)月，共布置鼠籠600個(gè)，共捕獲鼠形動(dòng)物123只，包括57只黃胸鼠、54只褐家鼠、11只臭鼩鼱和1只黑毛鼠。

2.2頭孢噻肟耐藥大腸埃希菌檢出情況與耐藥性分析 123份鼠形動(dòng)物樣本共成功分離35株耐頭孢噻肟大腸埃希菌，檢出率為28.5%，經(jīng)ESBL表型確認(rèn)全部是產(chǎn)ESBL菌株。其中褐家鼠16只，黃胸鼠13只，臭鼩鼱5只，以及黑毛鼠1只。35株產(chǎn)ESBL菌株對(duì)氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星以及左氧氟沙星耐藥率很高，分別為100%、91.4%、97.1%、100%、100%、88.6%、80%和74.6%。對(duì)頭孢他啶的耐藥率和中介耐藥率分別是54.3%和45.7%。亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素以及慶大霉素的耐藥率較低，分別為2.9%，2.9%，8.6%和31.4%(表1)。

2.3ESBL耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 35株菌一共檢出CTX-M耐藥基因37個(gè)，有2株菌攜帶了2種CTX-M耐藥基因。檢出blactx-m-7923株，blactx-m-556株，blactx-m-1234株，blactx-m-152株，blactx-m-65和blactx-m-27各1株。未檢出OXA、SHV和TEM型ESBL基因。

2.4MLST 35株菌一共鑒定出23個(gè)ST型，其中較多的分別是CC206-ST206(4株)、CC10-ST10(3株)、ST457 (3株)、CC446-ST602 (2株)和ST6388 (2株)。詳見表2。

2.5PFGE 35株菌，除一株菌的基因組DNA降解而沒有獲得條帶外其余34株菌都獲得條帶，共獲得34種帶型，相似度為36.2%～96.3%。34株菌中包含2個(gè)PFGE帶型相似度較高的簇，其中簇1包含4株菌，相似度為90.6%～96.3%，簇2包含2株菌，相似度為95.7%(圖1)。

表1 35株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的抗生素敏感性分析結(jié)果(N=35)Tab.1 Antimicrobial susceptibility profiles of 35 ESBLs-producing E.coli isolates

表2 35株攜帶CTX-M基因的大腸埃希菌所屬不同序列型和克隆系的數(shù)量Tab.2 Distribution of sequence types and CTX-M genes among blaCTX-M-containing E.coli isolates according to clonal complexes

圖1 34株大腸埃希菌PFGE聚類圖Fig.1 PFGE clustering diagram of 34 strains

3 討 論

我們對(duì)廣州市某居民區(qū)的鼠形動(dòng)物產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的檢測(cè)結(jié)果顯示ESBL陽性率高達(dá)28.5%，所有ESBL陽性菌株均攜帶CTX-M型基因。 Ho等對(duì)香港18個(gè)區(qū)的鼠形動(dòng)物進(jìn)行ESBL大腸埃希菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域之間檢出率差別較大，有2個(gè)區(qū)無檢出，有3個(gè)區(qū)檢出率高達(dá)21%～50%[10]；ESBL菌株中攜帶CTX-M型占92%，MLST顯示菌株遺傳多樣性。Guenther等[11]在德國柏林市區(qū)不同地點(diǎn)捕獲了老鼠87只，檢出67株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，陽性率高達(dá)77%。這些研究表明城市居民區(qū)鼠形動(dòng)物攜帶的大腸埃希菌ESBL陽性率普遍都很高，說明鼠形動(dòng)物可做為產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的儲(chǔ)存宿主。

最近，孟加拉的一篇報(bào)道從在醫(yī)院周邊垃圾堆覓食的烏鴉中分離到產(chǎn)ESBL大腸埃希菌。烏鴉攜帶CTX-M型ESBL大腸埃希菌的檢出率高達(dá)59%，而且很多CTX-M型基因都是臨床患者常見的型別，說明醫(yī)院周邊野生動(dòng)物可以從人獲得這些菌株或者CTX-M型基因[4]。國內(nèi)鐘雪珊報(bào)道了在廣州市某三甲醫(yī)院周邊居民區(qū)鼠型動(dòng)物攜帶肺炎克雷伯和銅綠假單胞菌的耐藥情況。發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的多重耐藥率為40.9%，產(chǎn)ESBLs菌株檢出率為10.7%。肺炎克雷伯菌與銅綠假單胞菌的耐藥譜與目前臨床患者菌株的耐藥譜相似，提示這兩種細(xì)菌可能在鼠形動(dòng)物與人之間有傳播[5]。由于醫(yī)院周邊環(huán)境易受醫(yī)院環(huán)境的影響，因此本文選擇遠(yuǎn)離醫(yī)院的居民區(qū)進(jìn)行鼠型動(dòng)物耐藥菌的研究。

本研究從捕獲的123只鼠型動(dòng)物分離到35株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，并從中檢出CTX-M耐藥基因37個(gè)。本研究檢出的所有CTX-M耐藥基因都曾在人臨床患者分離的耐藥菌株中檢出，如blactx-m-15是歐美國家產(chǎn)ESBL菌株中最常見的ESBL基因[12]。blactx-m-65和blactx-m-55基因在國內(nèi)人臨床和健康人群較常見[13-14]，blactx-m-123近年來在國內(nèi)人和動(dòng)物都有檢出[15]。blactx-m-79在本研究中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，這一ESBL基因過去并不多見，但近年檢出增多。2008年，田素飛等[16]首次報(bào)道在沈陽某社區(qū)老年健康人群中分離到blactx-m-79大腸埃希菌。此后美國也報(bào)道在農(nóng)場(chǎng)的小牛糞便中分離到blactx-m-79大腸埃希菌[17]，瑞士在江水中分離到blactx-m-79大腸埃希菌[18]，但這些文章中檢出的blactx-m-79大腸埃希菌數(shù)量都較少。本研究首次報(bào)道在鼠形動(dòng)物中檢出blactx-m-79且檢出率較高。近幾年，國內(nèi)也報(bào)道blactx-m-79在家禽和寵物犬的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌中占優(yōu)勢(shì)地位[19-20]。產(chǎn)CTX-M大腸埃希菌在動(dòng)物與人群中的優(yōu)勢(shì)型別存在差異的原因還不明了，甄盼盼等[21]研究認(rèn)為某些CTX-M基因可以和其它耐藥基因特別是氨基糖苷類耐藥基因位于同一質(zhì)粒上發(fā)生共同轉(zhuǎn)移，當(dāng)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)使用氨基糖苷類抗生素，就易于篩選出產(chǎn)CTX-M大腸埃希菌并促進(jìn)其擴(kuò)散。blactx-m-79是否也存在這種因素，需后續(xù)對(duì)blactx-m-79基因的周圍序列進(jìn)行深入研究來證實(shí)。

MLST發(fā)現(xiàn)35菌株多達(dá)23個(gè)ST型，而PFGE的結(jié)果也顯示帶型分布較為分散, 無優(yōu)勢(shì)帶型，表明這些鼠形動(dòng)物攜帶的ESBL菌株的遺傳多態(tài)性。目前的研究表明產(chǎn)ESBL大腸埃希菌攜帶的CTX-M基因大多位于細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒上，CTX-M基因可通過質(zhì)粒在細(xì)菌之間水平轉(zhuǎn)移，從而提高CTX-M基因的傳播，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼠形動(dòng)物產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的CTX-M基因是否位于質(zhì)粒上，并分析質(zhì)粒的傳播性以及鑒定耐藥質(zhì)粒特征。

綜上所述，本文從123只鼠型動(dòng)物檢出35株ESBL大腸埃希菌，檢出率高達(dá)28.5%，所有的ESBL基因型都是CTX-M型。本文檢出的CTX-M亞型中最常見的是blactx-m-79，需要進(jìn)一步研究來分析blactx-m-79在鼠形動(dòng)物中傳播的特征。MLST和PFGE的結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌菌株基因型呈現(xiàn)高度多態(tài)性。本研究結(jié)果表明鼠型動(dòng)物是產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的重要儲(chǔ)存宿主。

利益沖突：無