梁賓 榮伽玲 張曉康 何思穎 向陽 羅晶 張元珍 馬建鴻,3 楊國華 鄭芳,3

DDOD綜合征(dominant deafness and onychodystrophy syndrome, OMIM#124480)又稱先天性耳聾伴甲發(fā)育不全綜合征，是一種罕見的先天性異常疾病，該病的主要臨床特征是嚴(yán)重的感音神經(jīng)性聾和指甲發(fā)育不全或缺失[1]。1961年，F(xiàn)einmesser等首次報道了一個表現(xiàn)為耳聾、甲發(fā)育不全患者的家系，先證者為10歲女性，先天性聾，手指甲和腳趾甲營養(yǎng)不良且發(fā)育不全；其妹妹也有同樣的表型，即雙側(cè)感音神經(jīng)性聾伴甲發(fā)育不全[2]。隨后，Kondoh[3]和White[4]等發(fā)現(xiàn)該病為常染色體顯性遺傳。2014年，通過對兩個DDOD綜合征家系全外顯子測序,Yuan等[5]率先發(fā)現(xiàn)ATP6V1B2基因突變?yōu)镈DOD綜合征的致病原因。

本研究通過對一例先天性感音神經(jīng)性聾伴指甲和牙齒發(fā)育異常的患者外周血進(jìn)行二代測序，確定其致病突變位點并進(jìn)行遺傳學(xué)和生物信息學(xué)分析，為該家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 患者，女，6歲，出生時發(fā)現(xiàn)聽力異常，2013年5月外院聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試顯示雙耳反應(yīng)閾值為99 dB nHL，診斷為重度感音神經(jīng)性聾，人工耳蝸植入術(shù)后聽覺語言康復(fù)效果良好。于2019年7月來武漢大學(xué)中南醫(yī)院就診，查體發(fā)現(xiàn)先證者左右手拇指發(fā)育不對稱、牙齒部分發(fā)育異常(圖1)，父母聽力及表型均正常。本研究經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過并獲得患者及家屬知情同意。

圖1 先證者牙齒發(fā)育異常及左右拇指發(fā)育不對稱

1.2主要儀器及試劑 普通PCR儀 (Bio-Rad, USA)；外周血DNA提取試劑盒(OMEGA BIO-TEK)；PCR擴(kuò)增試劑盒(Thermo, EU)；PCR引物(天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

1.3外周血基因組DNA提取 于2019年7月在武漢大學(xué)中南醫(yī)院采集先證者及其父親、母親的空腹靜脈全血2 ml，EDTA-K2抗凝。按照外周血DNA提取試劑盒說明書操作，提取外周血DNA并進(jìn)行純度測定，保證DNA純度良好(A260/280nm：1.8～2.0，A260/230nm：1.9～2.5)，將提取的DNA置于-20 ℃保存。

1.4二代測序 將先證者及父母基因組送至上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技有限公司，通過探針雜交捕獲558個耳聾相關(guān)致病基因全部外顯子及毗鄰剪接區(qū)域(約50 bp)，并進(jìn)行富集。對富集的基因進(jìn)行質(zhì)量控制，利用高通量測序儀(Illumina HiSeq X)進(jìn)行測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)首先去除不符合質(zhì)控要求的reads，然后運(yùn)用BWA軟件與UCSC提供的hg19版本人類基因組參考序列進(jìn)行比對，通過OMIM、ClinVar、HGMD等數(shù)據(jù)庫對可疑突變進(jìn)行相關(guān)注釋，最終得到候選致病突變。

排除其他候選致病突變：先證者ESPN、USH2A基因上各發(fā)現(xiàn)一個雜合錯義突變，ESPN基因異?？蓪?dǎo)致常染色體隱性遺傳性聾36型；USH2A基因異常可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的視網(wǎng)膜色素變性39型或Usher綜合征IIA型，Usher綜合征IIA型的主要臨床表現(xiàn)為：出生時發(fā)生的感音神經(jīng)性聽力損失和進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性。ESPN、USH2A基因異常所致疾病與先證者臨床表現(xiàn)相關(guān)，但常染色體隱性遺傳病只檢測到先證者的一個雜合變異，其父母未檢測到，與遺傳方式不符合，故排除。

1.5Sanger測序驗證 用NCBI Primer-BLAST工具在線設(shè)計ATP6V1B2可疑致病突變位點c.1517G>A (p.R506Q)的引物，引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物序列如下：正向：CATCCTCTCCCGCAAGACTG，反向：ATAGCACTGAGGACCCAGGT。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括10×Taq DNA buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，Taq DNA聚合酶2 μL(1 U/μL)，ddH2O 30 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，模板DNA 5 μL(30～60 ng/μL)。擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min, 擴(kuò)增35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗證條帶單一且無外源DNA污染后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.6生物信息學(xué)分析 用UniProt(https:∥www.uniprot.org/)在線工具分析ATP6V1B2錯義突變位點在不同物種蛋白質(zhì)間的序列差異，以評估該突變位點處氨基酸的進(jìn)化保守性。用Mutation taster(http://www.mutationtaster.org/)在線工具預(yù)測錯義突變位點的潛在致病性。用PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)在線工具預(yù)測錯義突變位點對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和對其功能的影響。用ANTHEPROT 6.9.3軟件分析錯義突變對ATP6V1B2編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響。ANTHEPROT 6.9.3軟件蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)示意圖中，藍(lán)色模塊表示α-螺旋，紅色模塊表示β-折疊，白色模塊代表其他無規(guī)則松散結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)示意圖中，橫軸代表氨基酸序列，縱軸代表氨基酸親水性數(shù)值大小。

2 結(jié)果

2.1遺傳學(xué)分析結(jié)果 對先證者NGS結(jié)果分析顯示在遺傳性耳聾相關(guān)致病基因中，ATP6V1B2基因上有一個雜合突變位點c.1517G>A (p.R506Q)(圖2a)。一代驗證結(jié)果顯示先證者父母均未檢出該變異(圖2b、c)，推測該變異為新發(fā)變異，但不能排除父母一方存在生殖細(xì)胞嵌合的可能。將該變異與人類基因變異數(shù)據(jù)庫(HGMD)、NCBI-Clinvar數(shù)據(jù)庫和六萬人外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(ExAC)進(jìn)行比對，均未發(fā)現(xiàn)該突變位點的報道。

2.2生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果 用UniProt比對ATP6V1B2編碼的蛋白在人類、小鼠、大鼠、馬等多個物種中氨基酸的序列，結(jié)果顯示ATP6V1B2c.1517位點處的氨基酸在物種進(jìn)化中高度保守(表1)。用PolyPhen-2對突變位點進(jìn)行致病性預(yù)測，結(jié)果顯示ATP6V1B2c.1517G>A(p.R506Q)為致病性突變，綜合得分為1.00，提示該突變位點對蛋白質(zhì)的功能有較大影響(圖3a)；用Mutation taster對PolyPhen-2的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行輔助驗證，結(jié)果一致(圖3b)。用ANTHEPROT 6.9.3軟件對該基因編碼的野生型和突變型蛋白質(zhì)進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示ATP6V1B2p.R506Q突變可引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變，且可使該位點氨基酸的親水性增加(圖4)。

圖2 Sanger測序法驗證ATP6V1B2 c.1517G>A (p.R506Q) a.先證者; b.先證者父親; c.先證者母親

表1 ATP6V1B2c.1517(p.506)多物種序列比對

圖3 ATP6V1B2 c.1517突變致病性預(yù)測 a. PolyPhen-2預(yù)測結(jié)果; b.Mutation taster預(yù)測結(jié)果

圖4 ATP6V1B2 c.1517突變影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) a、b分別為野生型和突變型ATP6V1B2 c.1517附近蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)示意圖; c、d分別為野生型和突變型ATP6V1B2 p.506氨基酸親水性分析圖(紅線處指示突變位點)

3 討論

DDOD綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，又稱耳聾-甲發(fā)育不全綜合征，主要表現(xiàn)為先天性感音神經(jīng)性聾、甲發(fā)育不全、牙齒圓錐形伴間斷缺失。迄今為止，全球共報道了11例DDOD綜合征患者[6]，其中只有4例有明確的致病基因，均為ATP6V1B2c.1516 C>T (p.Arg506X)突變[5, 7]。ATP6V1B2是DDOD綜合征的主要致病基因，ATP6V1B2基因定位于染色體8p21.3，該基因總長度為2.875 kb，包括14個外顯子，編碼511個氨基酸。ATP6V1B2編碼囊泡型質(zhì)子泵蛋白 (V-ATPase)中的B2亞基。V-ATPase是一種由多亞基組成的質(zhì)子泵，水解ATP逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)H+[8]，通過酸化細(xì)胞器參與體內(nèi)多種重要的生理過程，如：蛋白的遞呈、代謝物質(zhì)的運(yùn)輸、受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用等[9, 10]。V-ATPase至少由14個不同的亞基組成，分為負(fù)責(zé)催化ATP結(jié)合和水解的胞質(zhì)水溶性V1區(qū)和負(fù)責(zé)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜疏水性的V0區(qū)，其中V0區(qū)至少由a、d、c、c’、c” 5個不同的亞基組成[11]，而V1區(qū)至少由A、B、C、D、E、F、G、H 8個不同的亞基組成。ATP6V1B2基因是V-ATPaseV1區(qū)的組成單位，在溶酶體、高爾基體、分泌型囊泡等多種細(xì)胞器膜上均有表達(dá)，廣泛分布在人體器官組織中，在維持人體細(xì)胞正常功能方面發(fā)揮重要作用[12]。

本研究對一例先天性感音神經(jīng)性聾伴手指、牙齒發(fā)育異常的先證者進(jìn)行遺傳學(xué)篩查，發(fā)現(xiàn)該先證者存在ATP6V1B2c.1517G>A (p.R506Q)雜合突變，父母表型正常且未檢出異常突變，通過檢索HGMD等多個變異數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，確證該位點為ATP6V1B2c.1517G>A (p.R506Q)新發(fā)突變。但尚不能排除由于其父母生殖細(xì)胞嵌合所致的后代突變，即父母生殖細(xì)胞存在正常和突變兩種類型，而父母的體細(xì)胞正常所以父母表型正常，而其后代繼承了生殖細(xì)胞的突變也就是胚系突變而出現(xiàn)病理表型。

生物信息學(xué)分析顯示，該突變位點具有高度的進(jìn)化保守性。突變位點致病性預(yù)測結(jié)果顯示，ATP6V1B2c.1517G>A (p.R506Q)為致病性突變，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測分析顯示，該突變會引起囊泡型質(zhì)子泵蛋白二級結(jié)構(gòu)及親水性發(fā)生改變，提示有可能是由于突變引發(fā)該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)改變造成囊泡型質(zhì)子泵蛋白的功能異常，從而對DDOD綜合征的發(fā)病產(chǎn)生影響。2014年Yuan等[5]發(fā)現(xiàn)ATV6V1B2基因第14外顯子相鄰的位點存在另一種變異ATP6V1B2c.1516 C>T (p.Arg506X)，該變異會導(dǎo)致溶酶體中的V-ATPases功能異常和酸化異常，并且應(yīng)用斑馬魚模型證實了ATP6V1B2變異導(dǎo)致DDOD綜合征的甲發(fā)育不全和指骨發(fā)育異常的表型。

值得注意的是，ATP6V1B2基因的致病變異不僅可以引起DDOD綜合征，ATP6V1B2c.1454 G>C (p.Arg485Pro) 還可以造成Zimmermann-Laband 綜合征 2 型(ZLS2) (OMIM#616455)的發(fā)生[13]。ZLS2是一種罕見的以面部發(fā)育異常伴有早期口內(nèi)彌漫性牙齦纖維增生為特征的綜合征。ZLS2患者通常表現(xiàn)出鼻突出，耳垂厚軟，指甲、遠(yuǎn)端指骨發(fā)育不良或缺失[14]。本研究中的患者沒有出現(xiàn)ZLS2的典型臨床表現(xiàn)如彌漫性牙齦纖維增生、顱頜面部畸形，但符合遠(yuǎn)端指骨發(fā)育不全這一特征。然而在什么情況下，ATP6V1B2基因的致病變異導(dǎo)致DDOD綜合征或ZLS2綜合征，目前尚不清楚。但已報道的致DDOD綜合征的突變ATP6V1B2c.1516 C>T (p.Arg506X)會插入一個過早的終止密碼子，使得蛋白被截斷，導(dǎo)致溶酶體的酸化功能異常。而致ZLS2綜合征的突變ATP6V1B2c.1454 G>C (p.Arg485Pro)是錯義突變，精氨酸被脯氨酸替換可能會通過破壞B亞基而擾亂V1亞基復(fù)合體內(nèi)各亞基間的相互作用而產(chǎn)生更加嚴(yán)重的表型。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)ATB6V1B2基因第14外顯子存在一個新變異ATP6V1B2c.1517G>A (p.R506Q)，結(jié)合患者典型的DDOD綜合征的臨床癥狀及生物信息學(xué)分析，推測該變異可能是其表型異常的主要原因，為該患者及其家系的遺傳咨詢提供了有力的分子依據(jù)。