葛海燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014100)

仔豬腹瀉是臨床中常見疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，引起仔豬腹瀉病原較多，主要包括大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等，其中致病性大腸桿菌是引發(fā)仔豬腹瀉的重要病原之一[1-3]。細菌生物被膜(Bacterial biofilm, BBF) 是組成結(jié)構性細菌群落的主要物質(zhì)，主要由附著細菌細胞和包裹細菌的水合性胞外聚合物物質(zhì)，在自然界中，當外界條件成熟，細菌均能夠形成生物被膜(Biofilm，BF)，生物被膜形成能力與細菌毒力及耐藥性具有一定相關性[4-5]。仔豬大腸桿菌病的防治主要以抗菌藥物為主，長期使用抗菌藥物，會致使大腸桿菌多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，降低抗菌藥物使用效果，同時也給人們健康帶來一定威脅[6-7]。

本試驗以臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌為研究對象，檢測并分析其進化分群、生物被膜形成能力、耐藥性及其相關性，為科學中合理用藥及防控該病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018-2019年，臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌、大腸桿菌質(zhì)控菌株 ATCC 25922均由本單位動物傳染病實驗室保存。

1.2 主要試驗材料 營養(yǎng)肉湯，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，購自青島高科園海博生物技術有限公司；臨床中常用藥物紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；96孔細菌培養(yǎng)板，購自上海研晶生物科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL-600 Marker，購自北京中科瑞泰生物公司；細菌DNA提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；常規(guī)的試驗試劑由本試驗提供。

1.3 細菌的復蘇與培養(yǎng) 取出-80 ℃保存的菌種，室溫解凍，無菌條件劃線接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基生長的單個菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中擴大培養(yǎng)，并進行計數(shù)。

1.4 細菌分子分群PCR鑒定 參考文獻[8]，設計大腸桿菌分子分群chuA、yiaA和TspE4.C2引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA，采用多重PCR方法對大腸桿菌進行系統(tǒng)分群鑒定，大腸桿菌系統(tǒng)分群進化判定標準見圖1。PCR反應體系25 μL：2×TaqMarker 12.5 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板1 μL，去離子水9.5 μL。94 ℃預變性 5 min; 94 ℃變性 30 s, 57.5 ℃復性 30 s, 72 ℃延伸60 s，30個循環(huán);最后 72 ℃延伸 5 min。將擴增后的 PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖上凝膠電泳檢測目的條帶。

圖1 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群的判定標準

表1 大腸桿菌分子分群引物序列

1.5 細菌的藥敏試驗檢測 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的標準藥敏試驗法進行操作和試驗結(jié)果判斷，以大腸桿菌 ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。調(diào)整分離菌株的濃度為0.5個麥氏濁度，無菌條件下均勻涂布在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量其抑菌圈直徑(mm)。

1.6 細菌的BF 檢測 按參考文獻[9]，采用結(jié)晶紫微孔板法對臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進行 BF形成能力測定。每株菌重復接種 10孔，在OD值595 nm下，重復檢測試驗孔和對照孔3 次，取均值。判定標準以陰性對照孔OD值的2倍作為判斷能否形成 BF 的臨界點ODc值，當OD值≤ODc值時，表示BF形成能力為0；當ODc值

2 結(jié)果

2.1 細菌分子分群鑒定 分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌均擴出來chuA、yiaA和TspE4.C2目的條帶。經(jīng)結(jié)果判定，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中，A群有8株、B1群有9株、B2群有17株、D群有12株，分別占分離菌株的16.7%、18.8%、35.4%、25.0%， 其中， B2群和D群流行為主(表2)。

表2 仔豬源致瀉性大腸桿菌系統(tǒng)進化分群鑒定結(jié)果

2.2 耐藥性檢測 由表3可知，分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素、氟苯尼考、恩諾沙星7種藥物耐藥性較高，耐藥率在58.3%～100.0%；對頭孢噻呋、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、林可霉素、大觀霉素5種藥物耐藥性相對較低，耐藥率在11.9%～31.3%。

表3 仔豬源致瀉性大腸桿菌的耐藥性分析結(jié)果

2.3 BF形成能力檢測 采用結(jié)晶紫微孔板法對臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進行 BF形成能力測定。臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中43株能形成BF，占分離菌株的89.6%(43/48)。其中，強形成膜能力菌株有 20株、中形成膜能力菌株有16株、弱形成膜能力菌株有7株、不形成BF菌株的有5株，分別占分離菌株的41.7%、33.3%、14.6%、10.4%。

2.4 BF形成能力與耐藥性相關性分析 由表4可知，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與強形成BF菌株的復合率在60.0%～100%，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與中形成BF菌株的復合率在56.3%～93.8%，多粘菌素、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林5種藥物耐藥性與強形成BF菌株的復合率在57.1%～100%。其余的抗菌藥物的耐藥性與BF形成復合率較低。說明多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性產(chǎn)生與BF形成能力有關。

表4 仔豬源致瀉性大腸桿菌耐藥性與BF形成能力相關性分析結(jié)果

3 討論

已有報道表明，大腸桿菌可分為 A、B1、B2 和 D 四個群，其中 B2 和 D 群被認為是主要的致病群[8-9]。研究表明，分離的致犬腹瀉性大腸桿菌分離株以B2、D群為主。本試驗表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中以B2群和D群流行為主，分別占分離菌株的35.4%和25.0%，與王明誠等[10]報道的基本上一致。但與李金朋等[9]報道具有一定的差異性，可能與地區(qū)有關。

大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生與抗菌藥物長期使用有關，還與其攜帶的耐藥機制有關，其攜帶耐藥質(zhì)粒在不同菌株之間傳播，引起其他菌株產(chǎn)生耐藥性[11]。本試驗表明，該地區(qū)分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對抗菌藥物耐藥性嚴重。與計徐等[12]、王克領等[13]的報道存在一定差異性。可能與地區(qū)、菌株耐藥性遺傳及臨床用藥不同，導致仔豬大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性存在一定的差異性。本試驗表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶等7種藥物耐藥性存在一定的相關性，說明仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與其產(chǎn)生的耐藥性有關，其BF形成能力增加大腸桿菌的耐藥性。與李金朋等[9]報道基本上一致。BF形成能力增強細菌耐藥性機理尚未明確，有待進一步研究。本試驗為該地區(qū)仔豬源致瀉性大腸桿菌病臨床合理用藥提供了試驗依據(jù)。