張慧敏 劉 志 李兆杰 王 靜

（1 威海海洋職業(yè)學(xué)院 山東威海264300 2 黃島海關(guān) 山東青島266555 3 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東青島266109 4 威海海關(guān)技術(shù)中心 山東威海264205）

合成著色劑指用化學(xué)方法合成的有機(jī)色素，絕大部分合成著色劑不能為人體提供營(yíng)養(yǎng)，一部分合成著色劑甚至還會(huì)危害人體健康。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014[1]列出了能夠在食品中使用的著色劑。國(guó)家有關(guān)部門出臺(tái)了相應(yīng)的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，然而合成著色劑的非法添加行為仍存在，例如：在鹵雞腿、鹵雞翅中發(fā)現(xiàn)添加了橙色Ⅱ[2]；在豆制品中發(fā)現(xiàn)添加橙色Ⅱ和酸性黃36[3]。這些合成著色劑價(jià)格低廉，穩(wěn)定性強(qiáng)，能為不法分子帶來(lái)高額利潤(rùn)，然而這些合成著色劑大部分含有芳香結(jié)構(gòu)，在人體內(nèi)可分解為芳香胺類物質(zhì)，這些芳香胺類物質(zhì)具有致癌、致疾、致突變等副作用[4-5]。基于合成著色劑種類繁多，給監(jiān)管工作帶來(lái)較大困難，有必要建立食品中多種合成著色劑的快速篩查方法。

食品中合成著色劑的檢測(cè)多采用電化學(xué)分析法[6]、薄層色譜法[7]、液相色譜法[8]、氣質(zhì)色譜法[9]和液-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]。電化學(xué)分析法、薄層色譜法均有靈敏度不高，選擇性不好等不足；氣質(zhì)色譜法不適用于分析難揮發(fā)、高沸點(diǎn)等合成著色劑；液相色譜法雖然常用，但是存在定性差等缺點(diǎn)。靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜可對(duì)多種未知物進(jìn)行篩查，在食品衛(wèi)生領(lǐng)域發(fā)揮重大作用[13]。

本文選擇市場(chǎng)上常見(jiàn)的28 種合成著色劑，采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法，可用于肉制品合成著色劑的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛公司；離心機(jī)、旋蒸儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）、Eclipse XDBC18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，3.5 μm），美國(guó)安捷倫公司；ACQUITY UPLC@BEN C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美國(guó)沃特世公司。

合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品：蘇丹橙G、蘇丹黃、蘇丹紅G、蘇丹紅7B、蘇丹藍(lán)Ⅱ、蘇丹黑B、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、酸性黃36、橙色Ⅰ、橙色Ⅱ、酸性黑Ⅰ、酸性深藍(lán)P-2RB、分散黃3、分散橙3、羅丹明110、反應(yīng)艷藍(lán)KN-3RL、酸性紅、赤蘚紅、誘惑紅、新紅、莧菜紅、亮藍(lán)、日落黃、檸檬黃、胭脂紅（純度≥95%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈（色譜純級(jí)），北京阿拉丁公司；乙酸銨、甲酸、丙酮、無(wú)水乙醇（分析純級(jí)），德國(guó)CNW 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 蘇丹類色素、分散黃3、分散橙3、羅丹明110 用乙腈配成2 000 mg/L 的儲(chǔ)備液，18 ℃下避光保存，其它合成著色劑用水配成2 000 mg/L 的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按照實(shí)際需要稀釋成所需濃度，置于4 ℃下避光保存。

1.2.2 色譜條件 C18超高效色譜柱型號(hào)為ZORBAX Eclipse Plus，流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。由乙腈（A）和乙酸銨水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～1 min，5%A；1～2 min，5%～10%A；2～3 min，10%～40%A；3～5 min，40%～95%A；5～13 min，95%A；13.1～15 min，10%A；15.1～17 min，5%A。

1.2.3 質(zhì)譜條件 正負(fù)離子模下電壓分別為3.5 kV 和2.8 kV；離子源溫度和金屬毛細(xì)管溫度分別為300 ℃和350 ℃；鞘氣壓力和輔助氣壓力分別為35 arb 和15 arb；掃描范圍為150～1 000 u；一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)離子全掃描分辨分別為70 000 和17 500；AGC target 分別為3e6和2e5；最大注入時(shí)間分別為100 ms 和50 ms；歸一化碰撞能為40 eV±50%。

1.2.4 樣品前處理 在5.00 g 樣品中加入5 g 無(wú)水硫酸鈉，樣品用15 mL 乙腈溶解，超聲提取10 min，8 000 r/min 離心5 min，重復(fù)提取1 次，收集乙腈提取液，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)盡干，用2 mL 乙腈∶水=8∶2（體積比）溶解，待定容；剩余殘?jiān)?5 mL乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)盡干，用2 mL 乙腈：水=8∶2（體積比）溶解，待定容。將2 份乙腈：水=8∶2（體積比）溶液合并，用乙腈：水=8∶2（體積比）定容至5 mL，渦旋30 s，過(guò)0.45 μm 濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

選取5 種常用溶劑比較，結(jié)果表明，乙腈對(duì)極性較強(qiáng)的合成著色劑提取效果較好，乙酸乙酯對(duì)極性較弱的蘇丹類物質(zhì)的提取效果較好，由于單一溶劑無(wú)法滿足28 種合成著色劑同時(shí)測(cè)定的要求。因此，先經(jīng)乙腈提取出極性較大的著色劑，再用乙酸乙酯提取出極性較小的著色劑。結(jié)果表明，采用兩種溶劑共同提取可以兼顧28 種合成著色劑的提取效率，可以大批量快速檢測(cè)。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

分析了乙腈-甲酸（0.1%）、甲醇-甲酸（0.1%）、甲醇-乙酸銨 （10 mmol/L）、乙腈-乙酸銨（10 mmol/L）等4 組流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，乙酸銨（10 mmol/L）-甲醇和乙酸銨（10 mmol/L）-乙腈兩組流動(dòng)相都能得到良好分離效果，而前者在蘇丹紅Ⅲ的色譜峰形方面表現(xiàn)不好，如圖1所示。因此，選擇乙酸銨（10 mmol/L）-乙腈作為流動(dòng)相。

圖1 蘇丹紅Ⅲ的保留時(shí)間Fig.1 Retention time of Sudan red Ⅲ

圖2 蘇丹橙G 在ACQUITY UPLC@BEN C18色譜柱的保留時(shí)間圖Fig.2 Retention time of Sudan orange G on ACQUITY UPLC@BEN C18 column

2.3 色譜柱的選擇

比較了28 種著色劑在3 種色譜柱的分離行為，分別為ACQUITY UPLC@BEN C18色譜柱、Eclipse XDB-C18色譜柱、ZORBAX Eclipse Plus C18。如圖2和圖3所示，蘇丹橙G 在前兩者色譜柱上的峰形不理想。蘇丹橙G 在后者色譜柱的分離效果較好。因此選擇ZORBAX Eclipse Plus C18。

圖3 蘇丹橙G 在Eclipse XDB-C18 色譜柱的保留時(shí)間圖Fig.3 Retention time of Sudan orange G on Eclipse XDB-C18 column

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Q-Extractive 高分辨質(zhì)譜可同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和二級(jí)離子掃描，其以母離子作為定量離子，通過(guò)全掃描確定28 種合成著色劑的保留時(shí)間，如圖4所示。精確質(zhì)量數(shù)對(duì)定性和定量非常重要，如表1所示，28 種合成著色劑的質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差小于3 μg/kg，符合歐盟2002/657/EC 中LC/MS 的要求[14]，可以根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)對(duì)28 種合成著色劑進(jìn)行定性。

圖4 28 種合成著色劑的保留時(shí)間Fig.4 Retention time of 28 synthetic colorant

表1 28 種合成著色劑的信息Table 1 Information of 28 synthetic colorant

（續(xù)表1）

一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率為70 000，28 種合成著色劑基本不受基質(zhì)效應(yīng)影響。碰撞能量設(shè)為40 eV±50%，能夠掃描出豐富的碎片離子。在高分辨質(zhì)譜中，母離子識(shí)別點(diǎn)和子離子識(shí)別點(diǎn)分別為2.0和2.5，歐盟EC 2002/657 號(hào)文件規(guī)定，對(duì)禁用物質(zhì)定性須有4 個(gè)識(shí)別點(diǎn)，一個(gè)母離子和一個(gè)子離子即可滿足定性要求[15]。28 種合成著色劑的碎片離子信息如圖5所示。

2.5 線性關(guān)系和檢出限

配制一組標(biāo)準(zhǔn)樣品，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法定量。以儀器所能檢出的最低濃度定為檢出限。結(jié)果如表2所示，檢出限在2.5～500.0 μg/kg 之間。

2.6 回收率及精密度

以豬肉、牛肉作為空白基質(zhì)，以3 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)分析，結(jié)果表明，28 種合成著色劑平均回收率在73.5%～109.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～10.0%之間。該方法回收率和重復(fù)性良好，可以滿足肉制品中28 種合成著色劑的日常檢測(cè)。

圖5 28 種合成著色劑的二級(jí)碎片離子信息Fig.5 Secondary fragment information of 28 synthetic colorant

表2 28 種合成著色劑的數(shù)據(jù)分析表Table 2 Data analysis table of 28 synthetic colorant

（續(xù)表2）

表3 28 種合成著色劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 28 synthetic colorant （n=6）

（續(xù)表3）

2.7 在實(shí)際樣品中的應(yīng)用

在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取20 份豬肉樣品和20 份牛肉樣品，用本方法進(jìn)行測(cè)定，在一份豬肉樣品中檢出酸性紅，檢出量為1.5 mg/kg。通過(guò)對(duì)比圖5和圖6，豬肉陽(yáng)性樣品中酸性紅提取離子色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖與圖5一致，可以進(jìn)行定性。

圖6 陽(yáng)性豬肉樣品中酸性紅的保留時(shí)間（a）和二級(jí)碎片離子（b）Fig.6 Retention time （a） and secondary fragment （b） of acid red in positive pork sample

3 結(jié)論

本研究通過(guò)高分辨質(zhì)譜，開(kāi)發(fā)了定性篩查和定量分析肉制品中28 種合成著色劑的方法。該方法快速、準(zhǔn)確，覆蓋酸性著色劑、堿性著色劑以及中性著色劑等多個(gè)種類，通過(guò)豐富的碎片離子，降低了假陽(yáng)性的出現(xiàn)幾率。