史海熠，潘 安，楊欣彤，張 淼，牛 明，顧 健，趙 丹，史志龍*

（1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 610041； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039； 3.昭通市第一人民醫(yī)院藥劑科，云南昭通 657000）

藏藥二十五味松石丸是經(jīng)典藏藥名方，由著名的藏醫(yī)名家宦侖扎哪創(chuàng)制，是藏區(qū)治療肝膽疾病的最常用的成藥之一。該方劑由松石、珍珠、牛黃、訶子等二十五味藏藥按照藏醫(yī)藥理論經(jīng)復(fù)雜炮制加工所得，現(xiàn)收載于《中國藥典》 中［1］，方中木香、丁香行氣止痛，牛黃、藏紅花解毒化濕，訶子、天竺黃、馬兜鈴等有清熱解毒的功能。近年研究表明，二十五味松石丸在治療急、慢性肝損傷，肝纖維化，乙型肝炎等方面均有顯著的療效［2-4］。二十五味松石丸以“涼”性功效藥物為主，可以平衡藏醫(yī)理論中“三因”學(xué)“赤巴”型的熱性，具有清熱解毒、清肝膽熱病的功效［5］，但目前關(guān)于它治療肝病的作用機制方面的文獻報道較少。

藏藥組方復(fù)雜，成分多樣，“多成分、多途徑、多靶點”協(xié)同作用在復(fù)雜疾病的治療上發(fā)揮著獨特優(yōu)勢。但由于其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制不明確，并且藏醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有明顯區(qū)別，給藏醫(yī)藥現(xiàn)代研究帶來很大的困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域新興的研究模式，目前已廣泛應(yīng)用在復(fù)方中藥現(xiàn)代化研究中［6-8］。本研究采用該方法分析二十五味松石丸主要活性成分及潛在作用靶點，研究其對疾病網(wǎng)絡(luò)的作用機理，進而探討其治療“赤巴”肝病的作用機制及應(yīng)用規(guī)律。

1 方法

1.1 目標化合物篩選 由于二十五味松石丸組方復(fù)雜，課題組前期開展了組方規(guī)律研究及減方后藥效對比研究，確定了核心配伍組分，結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)藥材中化合物的專屬性、類藥性（分子量、生物利用率、口服吸收等參數(shù)） 及藥理活性的相關(guān)報道，確定目標化合物，繪制三維結(jié)構(gòu)文件用于以下研究。

1.2 目標化合物作用靶點預(yù)測 將目標化合物的三維結(jié)構(gòu)文件通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫 （http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／），應(yīng)用基于蛋白組學(xué)的小分子探針對藥物作用靶點進行蛋白篩選，獲取與選取成分相關(guān)的信息。

1.3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及功能模塊注釋分析 利用String 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／string-db.org／） 構(gòu)建靶點蛋白間的相互作用 ［最低互分數(shù) （minimum required interaction score） 為0.4］，生成蛋白之間物理交互和功能相關(guān)的互作網(wǎng)絡(luò)。按照生物學(xué)功能的相關(guān)性提取蛋白質(zhì)密集連接的網(wǎng)絡(luò)，建立蛋白質(zhì)緊密互作的子集，并對模塊調(diào)控的相關(guān)功能進行描述。

1.4 GO 生物學(xué)功能注釋分析 對二十五味松石丸的120個預(yù)測靶點進行生物功能分析，收集P＜0.01 者，最小計數(shù)為3，富集因子＞1.5 （富集因子是觀測到的計數(shù)與隨機期望計數(shù)之比），根據(jù)其隸屬度相似性將其分組，得到GO、KEGG、Reactome 等通路的分析結(jié)果以及PPI 的富集結(jié)果。

1.5 二十五味松石丸活性成分-靶點-疾病生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 將二十五味松石丸有效活性成分作用的靶點蛋白通過Disgenet （http：／ ／www.disgenet.org／home／） 上的Summary of Gene-Disease Associations 數(shù)據(jù)庫對六種常見肝病相關(guān)靶點進行映射，篩選治療肝病的靶點。使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建成分-靶點蛋白-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，進行拓撲學(xué)分析，并對主要靶點作通路分析，預(yù)測藥物針對肝病的通路和作用機制。

2 結(jié)果

2.1 二十五味松石丸主要活性成分篩選 參考課題組前期對二十五味松石丸藥理活性及組方配伍規(guī)律的研究結(jié)果［5，9-10］，選擇牛黃、訶子、檀香、降香、鴨嘴花、余甘子、木香、綠絨蒿、木香馬兜鈴、船形烏頭、肉豆蔻、丁香、毛訶子、傘?；⒍荨⑻祗命S、西紅花、木棉花17 味藥材。

篩選二十五味松石丸主要活性成分時，遵循按單味藥物篩查的方式，優(yōu)先選取主要活性成分、專屬性成分、與肝病相關(guān)的成分，如牛黃中膽汁酸類和膽紅素、毛訶子中沒食子酸等［11-13］。結(jié)果，確定40 個目標化合物，見表1。

表1 二十五味松石丸目標化合物

2.2 構(gòu)建PPI 互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)功能模塊注釋分析 為了進一步探討靶點蛋白之間的相互關(guān)系，將靶點蛋白導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（圖1），對調(diào)控相似通路的蛋白集群進行ID 著色。結(jié)果，靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)中包含19 個子網(wǎng)絡(luò)，分別調(diào)控二氧化碳的可逆水合作用，蛋白質(zhì)自磷酸化等通路。

圖1 PPI 互作網(wǎng)絡(luò)

對PPI 互作網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系緊密的子集進行聚類構(gòu)建，建立出5 個子網(wǎng)絡(luò)（圖2），篩選出3 個可能性最高的生物功能信息作為每個子網(wǎng)絡(luò)的功能描述，其生物學(xué)功能注釋見表2。5 個靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)能夠調(diào)控PI3K 信號通路，調(diào)節(jié)有絲分裂細胞周期的G2／M 過程，聚酮化合物代謝過程，葡萄糖代謝過程以及影響G 蛋白偶聯(lián)受體。由此可以看出，二十五味松石丸作用靶點存在豐富的內(nèi)部互作，可通過“多成分多靶點”特點對上述5 個生物功能產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用，使其臨床應(yīng)用范圍有了拓展。

2.3 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將化合物結(jié)構(gòu)信息導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／） 進行靶點預(yù)測，選擇與人類基因結(jié)合可能性≥30% 的蛋白作為成分作用靶點，共計120 個。從OMIM、Disgenet 等數(shù)據(jù)庫中篩選常見肝病（包括肝癌、肝損傷、肝硬化、脂肪肝、肝腫大、乙型肝炎） 的基因、蛋白等靶點，對篩選的藥物作用靶點進行映射。

圖2 生物功能模塊

將藥物、化合物、靶點蛋白和疾病的相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建組分-作用靶點-疾病之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。牛黃、丁香、綠絨蒿、西紅花、余甘子、木棉花、鴨嘴花、訶子、毛訶子九味藥物通過120 個靶點作用于6 種肝病；不同組分可作用于相同的靶點，不同靶點之間又相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控肝病，體現(xiàn)了二十五味松石丸多成分、多靶點的作用特點。其中，對肝癌的作用靶點最多，其次是肝硬化、乙型肝炎，表明二十五味松石丸在治療肝癌方面有著潛在的開發(fā)價值。肝硬化是很多慢性肝病發(fā)展過程中的階段，存在多種病因［14］，在我國主要是乙型肝炎引起的肝硬化［15］。通過對疾病靶點的篩查發(fā)現(xiàn)，二十五味松石丸對肝纖維化和肝損傷的作用靶點較少，與乙型肝炎靶點匹配結(jié)果較好，即僅對感染性肝病，尤其是乙型肝炎所引起的肝硬化有治療效果。

表2 功能模塊生物學(xué)功能注釋

圖3 組分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

Degree 表示和節(jié)點相連的線數(shù)目，代表該節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中的重要性，本實驗篩選網(wǎng)絡(luò)中Degree ≥Average Degree 的47 個核心節(jié)點，包括 AKT1、EGFR、SRC、MMP9、KDR 等（表3）。越來越多的研究表明，許多實體腫瘤中存在EGFR 的高表達［16］，此外MMP-2、MMP-9 這2個靶點還參與肝癌細胞對組織的侵襲轉(zhuǎn)移過程［17］。

對藥味進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)合靶點最多的是綠絨蒿、毛訶子、西紅花3 味藥物，見表4～5。課題組對二十五味松石丸配伍特點的前期研究表明，包括綠絨蒿、毛訶子在內(nèi)的11 種“澀”味藥、以牛黃為首的7 種“苦”味藥、以西紅花為首的3 種“甘”味藥主要用于治療“赤巴”的熱性疾病，起到了清肝、膽熱的功效。在《藏漢合璧常用藏成藥使用手冊》 《新修晶珠本草》 《四部醫(yī)典》《藏藥與方劑》 中整理得到的21 種治療肝病的常用藏藥方劑中，使用頻率最高的為西紅花和牛黃［5］，為傳統(tǒng)藏醫(yī)理論中的“主”藥，同時其他幾味“仆”藥作用于部分靶點，對二十五味松石丸整體治療各類肝病做出了貢獻［18］。

2.4 基因功能和通路分析 將二十五味松石丸對肝病的120 個潛在作用靶點通過Metascape 網(wǎng)站進行GO 生物功能注釋［19］，篩選P值排名前20 的通路，見圖4、表6。其中，殼聚糖代謝過程（icosanoid metabolic process） 所代表的是任何一組碳二十不飽和脂肪酸中的化學(xué)反應(yīng)和途徑，而PID PTP1B pathway 是參與調(diào)控蛋白酪氨酸磷酸酶1B 的通路，該通路可抑制脂肪肝的發(fā)生。此外，還包括脂質(zhì)代謝（metabolism of lipids）、EGFR-TKI 耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance） 等18 條通路。

表3 關(guān)鍵靶點及其拓撲學(xué)參數(shù)（前10 位）

表4 組分拓撲學(xué)參數(shù)

表5 疾病拓撲學(xué)參數(shù)

3 討論

二十五味松石丸為藏醫(yī)經(jīng)典成方，是藏醫(yī)治療各類肝病的常用藥物，由于藏醫(yī)藥現(xiàn)代研究薄弱，藏醫(yī)藥理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有著較大差異，臨床應(yīng)用范圍不明確，作用機制不清，嚴重阻礙了臨床應(yīng)用及療效的穩(wěn)定發(fā)揮。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討二十五味松石丸在肝病治療上應(yīng)用規(guī)律及可能的作用機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，二十五味松石丸中九味成分作用于6 種常見肝病的120 個靶點，可以對肝癌、乙型病毒性肝炎和肝硬化等常見肝病的靶點產(chǎn)生調(diào)控作用，明確了二十五味松石丸臨床應(yīng)用范圍。

圖4 KEGG 通路富集分析

在進一步對潛在作用靶點分析過程中發(fā)現(xiàn)，二十五味松石丸部分目標化合物參與殼聚糖代謝過程，促進殼聚糖水解生成WCS 和COS，有報道顯示殼聚糖及其衍生物具有防治藥物性肝損傷的作用［20］。此外，二十五位松石丸調(diào)控PID PTP1B 通路從而影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有研究顯示該通路與脂肪肝的發(fā)生有著密切的聯(lián)系［21］。另外通路富集分析中發(fā)現(xiàn)EGFR 通路為二十五味松石丸關(guān)鍵通路，有研究表明EGFR 與腫瘤細胞黏附、增殖、轉(zhuǎn)移以及腫瘤新血管的生成有關(guān)［22］，這顯示出二十五味松石丸具有潛在腫瘤藥物開發(fā)價值。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立肝病靶點，并構(gòu)建組分-靶點-疾病作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，對二十五味松石丸的作用靶點、通路進行了系統(tǒng)性分析，初步闡釋了該方作用機制，可為其后續(xù)研究提供思路。

表6 GO 分析