左青青，錢 露，高 瑜，熊 婷，肖佩林，徐 榕，李 林，錢 剛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細胞生物學(xué)教研室 貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院2016級本科生，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系2017級本科生，貴州 遵義 563099)

全緣千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don)是具有良好開發(fā)前景的抗菌中草藥[1]，其功用主要表現(xiàn)為對風(fēng)熱感冒、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹瘡癤等感染的治療上[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究揭示，千里光在抗菌、抗鉤端螺旋體、抗滴蟲、抗氧化以及自由基清除活性等方面功效顯著[3]。

染色體核型分析能夠從物種的細胞學(xué)水平直觀顯示染色體數(shù)目、形態(tài)、整體結(jié)構(gòu)等特征[4-5]，物種之間染色體核型差異可以反映物種遺傳進化過程的基本規(guī)律，從系統(tǒng)植物學(xué)的角度揭示物種起源與演化，并由此判斷物種間的親緣關(guān)系，闡明該物種的細胞遺傳學(xué)機制。因此，核型分析成為物種分類研究的重要依據(jù)，是研究物種的分化、系統(tǒng)演化途徑、親緣關(guān)系、遠緣雜交及遺傳工程的基本手段[6]，被廣泛應(yīng)用于植物分類學(xué)研究[7]。

我國的菊科千里光族(Senecioneae)植物種類繁多，包括23屬434種[8]，迄今，通過細胞遺傳學(xué)手段對千里光族植物類群開展的研究極其有限，目前報道的僅涉及橐吾屬、合耳屬、垂頭菊屬等少數(shù)物種[9]，這導(dǎo)致千里光族植物各類群間的界定關(guān)系不明確且缺乏系統(tǒng)性，物種起源與演化仍沒有定論。在此，本文以全緣千里光為研究材料，探討菊科千里光屬近緣物種的演化及系統(tǒng)分類學(xué)特征，為千里光雜交育種的細胞遺傳學(xué)機制提供基礎(chǔ)試驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料 參試材料全緣千里光野生種群采自貴州省遵義地區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)錢剛教授篩選、檢測，選擇遺傳性狀穩(wěn)定的強抗菌千里光植株為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 材料的扦插 選取生長勢良好、無損傷、無病蟲害的千里光植株，插穗為2～3節(jié)的無葉莖段，長度約10±2 cm，其生長前端的腋芽利用600 mg/L NAA處理2 h，無菌水清洗后扦插于5%的KMnO4溶液消毒后的河沙中，置于22～25 ℃、相對濕度85±5%的溫室，日常管理用MS液體培養(yǎng)基(10 ×)澆灌以保持表層土壤濕潤。30 d后取出扦插株，并用去離子水將根洗凈后置于MS液體培養(yǎng)基(10 ×)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 取材與固定 待根繼續(xù)延伸至2～3 cm時，剪取長度約0.5 cm根尖于冰水混合物，預(yù)處理15 h后，轉(zhuǎn)入新配置的卡諾固定液固定24～48 h。

1.2.3 酶解 將固定后的試驗材料置于0.075 mol/L KCL溶液前低滲處理30 min后，用去離子水沖洗3～5遍，于37 ℃恒溫環(huán)境下，用2.5%果膠酶和2.5%纖維素酶混合液(pH=5.5，由PBS溶解)處理60～90 min之后，用去離子水低滲處理40～60 min，備用。

1.2.4 制片與染色 將試驗材料放置于預(yù)冷的載玻片上，滴加少量雙蒸水以保持根尖處于液體環(huán)境，用解剖針壓平根尖(長度為2～4 mm)，滴加適量卡諾氏固定液，晾干，滴加0.1 μg/mL苯酚品紅染液，染色20 min以上，蓋上蓋玻片后用濾紙吸去多余染液，輕敲蓋玻片、壓片。

1.2.5 染色體檢測與核型分析 染色體標本制備完畢，經(jīng)顯微鏡觀察，選擇25個染色體分散良好、著絲點清晰的分裂相用于染色體形態(tài)觀察和數(shù)目的統(tǒng)計，利用Photoshop CS 軟件測量每個細胞的染色體長臂、短臂和總長度。核型分析標準參考李懋學(xué)和陳瑞陽(1985)[10]的方法，二點四區(qū)系統(tǒng)標準被用于確定著絲粒位置[11]，不對稱性系數(shù)按照Stebbins(1971)[12]方法計算。其中，核型分析相關(guān)參數(shù)如臂比(Arm ratio)、染色體相對長度(Index of relative length)、核型不對稱系數(shù)(Asymmetric karyotype coefficient,AKC)和著絲粒指數(shù)(Centromere index)的計算公式如下：臂比=長臂長度/短臂長度；染色體相對長度=(染色體長度/染色體組總長)× 100%；核型不對稱系數(shù)(%)=(染色體長臂總長/全組染色體總長)× 100%；著絲粒指數(shù)(%)=(短臂長度/染色體組全長)× 100%。按Levan(1964)的標準劃分：臂比在1.0～1.7之間為中部著絲粒染色體；臂比在1.7～3.0之間為亞中部著絲粒染色體；臂比在3.0～7.0為亞端部著絲粒染色體；臂比大于7.0者為端部著絲粒染色體。

2 結(jié)果

2.1 染色體組分析 為了確定染色體倍數(shù)，我們選擇細胞周期中既有處于有絲分裂中期，也有處于有絲分裂中后期的分裂相(見圖1A)。當(dāng)細胞分裂相處于有絲分裂中期時，每條染色體由兩條染色單體構(gòu)成(見圖1B)；當(dāng)細胞周期進入有絲分裂中后期，染色體從著絲粒處分離，每條染色體含有1條染色單體，此時細胞并沒有一分為二，染色體數(shù)目為40條(見圖1C)，由此確定千里光為二倍體。

A：有絲分裂中期(紅色箭頭)和有絲分裂中后期(黑色箭頭)；B：有絲分裂中期的染色體組(黑色箭頭)；C：有絲分裂中后期的染色體組(黑色箭頭)。

2.2 染色體形態(tài) 選擇細胞分裂相處于有絲分裂中期的圖片25張，均未發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常的染色體；通過觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的其它分裂相的細胞，包括細胞周期處于中后期或后期的分裂相，也未觀察到隨體和端部著絲粒染色體，染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)均相對穩(wěn)定(見圖2)。

圖2 全緣千里光有絲分裂中期的染色體形態(tài)

2.3 染色體數(shù)目 根據(jù)植物核型分析標準，選取染色體分散良好、形態(tài)清晰的有絲分裂中期的分裂相，此時每條染色體含有1個著絲粒，每條染色體含有2條染色單體的細胞分裂相，綜合有絲分裂中期和中后期著絲粒的個數(shù)可確定，千里光的染色體數(shù)目為2n=2x=20(見圖3)。

圖3 全緣千里光染色體核型

本研究發(fā)現(xiàn)，10對千里光染色體的組成由8對中部著絲粒染色體(m)和2對亞中部著絲粒染色體(sm)組成，未發(fā)現(xiàn)隨體，核型公式為：2n=2x=20=8m+2sm(2SAT)(見圖4)。

圖4 全緣千里光染色體核型模式分析

2.4 染色體核型參數(shù) 基于植物核型分析標準，在測量每一組染色體的長臂和短臂之后，根據(jù)公式計算其染色體相對長度、臂比、著絲粒指數(shù)以及染色體相對長度指數(shù)等指標。結(jié)果顯示，千里光染色體全長在2.168～2.984 μm，相對長度為8.607～11.847%，臂比值介于1.023～2.267之間，平均臂比值1.408，核型不對稱系數(shù) 為57.78%，最長與最短染色體的比值為1.376。綜合相關(guān)參數(shù)，千里光(菊科-千里光屬)的核型屬2A型(見表1)。

表1 全緣千里光染色體核型參數(shù)

3 討論

關(guān)于千里光族植物系統(tǒng)發(fā)生與演化，目前得到普遍認同的觀點是菊科千里光族早期進化過程中分化為兩個相對獨立的支系，即千里光支系(X=10)和款冬支系(X=30)，之后千里光族近緣物種的演化沿著這兩個支系進行[8,13]。目前，有研究對千里光族幾個代表性物種的系統(tǒng)植物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，千里光屬(X=10)與橐吾屬(X=15)和大風(fēng)草屬(X=15)的遺傳關(guān)系較遠(Senecio)；與染色體核型基數(shù)相同(X=10)的垂頭菊屬、合耳菊屬的親緣關(guān)系最近[8-9]。本研究結(jié)果顯示，千里光屬中部和亞中部著絲點染色體，未發(fā)現(xiàn)多倍體和非整倍體染色體組，表明千里光屬植物的遺傳特性穩(wěn)定。此外，Stebbins[12]的研究表明，染色體核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展，本研究發(fā)現(xiàn)千里光的核型不對稱系數(shù)介于50.57%和69.38%之間(見表1)，即該物種的核型對稱性較高，表明千里光屬植物是進化速度緩慢、遺傳性狀穩(wěn)定的原始物種。

鑒于同一物種的染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)等保持相對恒定，植物染色體組的測定及組型分析是細胞遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容[14-15]，因此，植物核型分析及相關(guān)參數(shù)不僅有助于揭示植物資源的系統(tǒng)發(fā)生、物種演化以及物種間的親緣關(guān)系[2]，還有助于解析生物的遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機制，進而對作物的遺傳育種提供細胞學(xué)參考資料[16]；于是，核型分析的種間親緣關(guān)系鑒定和植物新品種的選育提供指導(dǎo)作用[17]。本研究中千里光參試資源的核型公式同為2n=2x=20=8m+2sm(2SAT)，屬于典型的對稱性核型，符合2A型分類標準；然而，與已報道的菊科千里光族核型相比較[8]，不對稱系數(shù)、染色體相對長度和臂比值等染色體核型參數(shù)存在差異，表明千里光屬的不同種或亞種之間的染色體結(jié)構(gòu)存在差異。由此推知，千里光屬植物的遺傳育種過程中，染色體結(jié)構(gòu)差別可能會對千里光的遠緣雜交產(chǎn)生影響，其細胞遺傳機制在于染色體配對障礙的生殖隔離可導(dǎo)致雜種不育。

迄今，就千里光屬植物的不同種或亞種之間分類標準而言，仍采用傳統(tǒng)的植物形態(tài)結(jié)構(gòu)進行分類，即以葉片的形態(tài)分為掌裂千里光(SinoseneciopalmatisectusC.Jeffreyet Y.L.Chen)、羽葉千里光(SeneciojacobaceaL.)、麻葉千里光(SeneciocannabifoliusLess.)和全緣千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don)，缺少穩(wěn)定可靠的細胞和分子水平上的分類依據(jù)。于是，有觀點認為，物種的不同種或亞種間核型差異主要體現(xiàn)在染色體數(shù)目和形態(tài)方面的變化，尤其是一些近緣物種[1]；因此，在研究植物種、亞種或不同居群之間的親緣關(guān)系時，由于具有相同數(shù)目的染色體，染色體形態(tài)特征可能是分析物種演化趨勢之關(guān)鍵[18]。此外，有研究證實，無論是在核型公式、核型對稱性，或者隨體的有無，物種不同資源產(chǎn)地的核型均存在細微差異[19]，可能源自物種長期進化過程中，因適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)變異以降低植物對環(huán)境的選擇壓力，進而表現(xiàn)為種內(nèi)核型的多態(tài)性；本研究結(jié)果與千里光族其它成員之間染色體核型參數(shù)的差異[9]也印證了這一觀點。