,*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316000;2.浙江工商大學(xué),浙江杭州 310000;3.浙江海洋大學(xué)，浙江舟山 316000)

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物中的低分子質(zhì)量(6～7 kDa)、無(wú)芳香族氨基酸、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白[1-2]。MT分子易與鋅、銅、鎘重金屬離子等結(jié)合,是一類可誘導(dǎo)的蛋白。在過(guò)去的研究中,采用銅、鋅、鎘等重金屬飼喂或注射動(dòng)物誘導(dǎo)其產(chǎn)生MT[3]。MT中大量巰基賦予了其螯合重金屬離子功能及重金屬解毒作用,可調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度。MT清除自由基的能力明顯強(qiáng)于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖分化。其在食品、醫(yī)藥、保健、環(huán)境、化妝品、生物工程等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[4-5]。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上,MT純度在95%以上約20 萬(wàn)/g[6],價(jià)格昂貴使研究應(yīng)用受到限制。因此建立MT的高效提取工藝具有重要意義。毛蚶屬于濾食性雙殼貝類,體內(nèi)易富集重金屬,且價(jià)格低廉易于養(yǎng)殖,資源豐富[7],是提取金屬硫蛋白的理想原材料。

目前關(guān)于金屬硫蛋白的提取已有部分研究,多數(shù)采用緩沖液浸提離心法,但發(fā)現(xiàn)MT在天然動(dòng)物體內(nèi)含量較低,大大影響了其提取效率,而且任何目標(biāo)產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的提取都需經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的柱層析純化過(guò)程,因此,原材料中目標(biāo)產(chǎn)物或蛋白的含量是制約其提取效率的關(guān)鍵點(diǎn),因此在進(jìn)行提取前如何提高天然動(dòng)物中目標(biāo)產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的含量具有重要意義。本研究選取毛蚶為研究對(duì)象,通過(guò)Zn2+誘導(dǎo)毛蚶體內(nèi)產(chǎn)生 MT[8-9],并優(yōu)化了提取工藝。通過(guò)研究提取液濃度、液料比、提取溫度、提取液pH等提取因素對(duì)提取液中MT含量的影響,在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到MT最佳的提取條件,為下一步金屬硫蛋白的分離純化提供原材料,同時(shí)為MT的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蚶 購(gòu)自浙江省舟山市東河水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng),殼長(zhǎng)(5±0.5) cm,殼高(3±0.5) cm,體重:30～40 g;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 生物試劑純,北京索萊寶科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;兔肝-MT對(duì)照品 純度98.5%,大連聯(lián)合博泰生物技術(shù)有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉 均為優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)。

UV-3100BPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;T18勻漿機(jī) 德國(guó)艾卡(ULTRAT-URRAX);JXN-30高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特(Beckman Coulter Avanti);ETHOS UP微波消解儀 邁爾斯通(Milestone);7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 安捷倫;LABCONCO凍干機(jī) 北京中科科爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛蚶體內(nèi) MT 的誘導(dǎo)表達(dá) 選取生長(zhǎng)活力良好的毛蚶個(gè)體,擦洗去除體表粘附的生物后放入玻璃養(yǎng)殖箱中,20只/箱,箱內(nèi)注入充氧氣的天然海水(鹽度24‰±1‰,pH8.0±0.2,水溫(23±1)℃),暫養(yǎng)2 d,期間不投喂餌料。之后每天更換含50 μmol/L氯化鋅海水,期間不投喂飼料,誘導(dǎo) 7 d后,取出毛蚶個(gè)體,在 0～4 ℃條件下解剖毛蚶,將其組織勻漿后,置于-60 ℃條件下貯存?zhèn)溆肹10]。

1.2.2 毛蚶中金屬元素的測(cè)定 參考現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB 5009.268-2016測(cè)定毛蚶中的金屬元素。取適量組織微波消解后,使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定毛蚶中Zn元素含量[11]。

1.2.3 毛蚶中MT含量的測(cè)定 采用5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作為金屬硫蛋白(MT)巰基衍生化試劑,通過(guò)比色法測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處顯色產(chǎn)物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量確定金屬硫蛋白含量[12]。該方法簡(jiǎn)單快捷,精密度良好,線性回歸方程為:y=0.0065x-0.0044(R2=0.9995)。

1.2.4 毛蚶中MT的提取

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 取毛蚶組織約 2 g,按提取液∶組織勻漿液比例分別為2∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1 mL/g,加入0.1 mol/L,pH為 8.0的Tris-HCl提取液,40 ℃恒溫水浴振蕩(轉(zhuǎn)速180 r/min)提取90 min后,4 ℃下,8000 r/min離心20 min,收集上清液測(cè)定MT含量,研究液料比對(duì)毛蚶MT提取量的影響。

取毛蚶組織約2 g,按提取液∶組織(mL/g)比例6∶1加入0.1 mol/L,pH8的Tris-HCl提取液,充分混勻,分放在20、30、40、50、60、70 ℃的條件下恒溫水浴振蕩提取90 min 后,4 ℃下,8000 r/min離心20 min,收集上清液測(cè)定MT含量,研究提取溫度對(duì)毛蚶MT提取量的影響。

取毛蚶組織約2 g,按提取液∶組織(mL/g)比例6∶1分別加入到pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.1 mol/L Tris-HCl提取液,40 ℃恒溫水浴振蕩提取90 min 后,充分混勻,4 ℃,8000 r/min離心20 min,收集上清液測(cè)定MT含量,研究緩沖液pH對(duì)毛蚶MT提取量的影響。

取毛蚶組織約2 g,按提取液∶組織(mL/g)比例6∶1分別加入到pH為8濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L Tris-HCl提取液,40 ℃恒溫水浴振蕩提取90 min后,充分混勻,4 ℃ 8000 r/min離心20 min,收集上清液測(cè)定MT含量,研究提取液濃度對(duì)毛蚶MT提取量的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),在四因素三水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),進(jìn)行毛蚶金屬硫蛋白提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化分析。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1 繪制曲線,Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面的繪制,應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘導(dǎo)前后毛蚶組織中Zn2+和MT含量變化

ICP-MS檢測(cè)Zn2+元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=3.7561E-005X+0.0013,r=0.9997。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)生物體毒害作用小的鋅離子誘導(dǎo)。由表2可知,采用50 μmol/L氯化鋅誘導(dǎo)效果顯著(P<0.05)。毛蚶組織中Zn2+含量與MT含量顯著提高(P<0.05),說(shuō)明毛蚶在Zn2+誘導(dǎo)下,體內(nèi)MT合成增加。

表2 誘導(dǎo)前后毛蚶組織中 Zn2+和MT 含量Table 2 The contents of Zn2+ and MT in theArca subcrenata tissues before and after induction

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 液料比對(duì)毛蚶MT提取含量的影響 Tris-HCl緩沖液性質(zhì)穩(wěn)定,與生理體液的相容性好,采用Tris-HCl緩沖液提取毛蚶中MT,不僅有效促進(jìn)蛋白的溶出,并提供穩(wěn)定的環(huán)境,減少蛋白的變性[6,13]。由圖1可知,在提取過(guò)程中,隨著提取液體積增加MT含量逐漸提高;當(dāng)液料比為6∶1時(shí),MT含量達(dá)到最大值為0.406 mg/g;繼續(xù)增大提取液的量,MT提取含量變化趨于平緩,說(shuō)明當(dāng)液料比達(dá)到一定值時(shí),對(duì)MT提取含量不再有顯著影響(P>0.05)。提取液過(guò)多會(huì)降低提取液中MT的濃度,對(duì)后續(xù)的測(cè)定和使用造成不便,同時(shí)還增加了提取成本。因此,初步確定毛蚶組織與提取液的液料比為4∶1～6∶1 mL/g。

圖1 液料比對(duì)毛蚶MT提取含量的影響Fig.1 Effect of material ratio on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.2.2 提取溫度對(duì)毛蚶MT提取含量的影響 研究表明,金屬硫蛋白具有很好的熱穩(wěn)定性,在80 ℃條件下加熱3 min后變性失活[14],因此提取溫度設(shè)置在20～70 ℃范圍內(nèi)。由圖2可知,隨著提取溫度的增加,MT含量增大,隨后逐漸降低。溫度達(dá)到40 ℃時(shí)MT含量達(dá)到最大。溫度繼續(xù)升高可能會(huì)破壞MT的活性。有學(xué)者認(rèn)為,短時(shí)間高溫加熱,可除去雜蛋白,但是時(shí)間尚未確定,存在較多弊端[15]。因此,初步確定提取溫度為30～50 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)毛蚶MT提取含量的影響 Fig.2 Effect of temperature on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.2.3 提取液pH對(duì)毛蚶MT提取含量的影響 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)(pI)時(shí),其溶解度最小,最易形成沉淀物,水生生物MT的pI通常在3.5～6.0范圍內(nèi)[16],因此提取液pH設(shè)置在3～9范圍內(nèi)。由圖3可知,pH對(duì)提取效果影響較大,隨著提取液pH的變化,MT提取含量先增加再降低。因此,初步確定最佳提取液pH為8。

圖3 提取液pH對(duì)毛蚶MT提取含量的影響 Fig.3 Effects of pH on extraction of MT from Arca subcrenata

2.2.4 提取液濃度對(duì)毛蚶 MT 提取含量的影響 由圖4可知,在0.01～0.5 mol/L范圍內(nèi),MT含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在0.1～0.2 mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)最大值。因此,初步確定最佳提取液濃度為 0.2 mol/L。

圖4 提取液濃度對(duì)毛蚶MT提取含量的影響Fig.4 Effects of buffer concentration on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)MT提取效果具有顯著影響的4個(gè)單因素,即提取液pH(A)、提取溫度(B)、提取液濃度(C)、液料比(D)。通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn),得到線性回歸方程,對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行分析,得到毛蚶中MT最佳提取條件。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以提取液中MT含量為響應(yīng)值,進(jìn)行29組實(shí)驗(yàn),其中包括24組析因?qū)嶒?yàn)及5組中心實(shí)驗(yàn)用來(lái)估算誤差,結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 二次多項(xiàng)模型方差分析Table 4 ANOVA for the quadratic polynomial model

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 利用Design Expert 8.0.6軟件,對(duì)表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到表4。以提取液中MT含量為響應(yīng)值,對(duì)響應(yīng)值與四個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合后,得到回歸方程如下:R=0.66-2.635E-003A-0.077B-0.027C+0.093D-0.10AB+3.714E-0.03AC+0.027AD-2.128E-003BC-0.020BD+0.084CD-0.089A2-0.13B2-0.058C2-0.068D2。

圖5 溫度和提取液pH對(duì)MT提取效果的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on the extraction of MT from Arca subcrenata

圖6 提取液pH和提取液濃度對(duì)MT提取效果的影響Fig.6 Effect of pH and buffer concentration on the extraction of MT

P值的大小代表了模型與各單因素的顯著水平[17],由表4方差分析可知:模型的P<0.0001,表明實(shí)驗(yàn)采用的二次模型是極其顯著的,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。失擬項(xiàng)反映了所用模型與實(shí)驗(yàn)的擬合程度,即兩者差異程度。失擬項(xiàng)的P=0.055>0.05,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該方程模型失擬不顯著,擬合程度較好,可用該模型推測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4還可以看出,四個(gè)因素中,交互相AB、CD對(duì)MT含量具有極顯著影響(P<0.01)。本模型中，決定系數(shù)R2=0.90,變異系數(shù) C.V.=10.9%,說(shuō)明該模型能夠解釋90%的響應(yīng)值變化,即該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差較小,適合于毛蚶中MT提取量的分析和預(yù)測(cè)。由P值可以看出,不同提取因素對(duì)MT含量影響的順序?yàn)?液料比>提取溫度>提取液濃度>提取液pH。此外,Pred R-Squared值(0.446)與Adj R-Squared值(0.805)相差很大,亦表明該響應(yīng)面方程需要做進(jìn)一步的優(yōu)化。

圖7 提取液pH和液料比對(duì)MT提取效果的影響Fig.7 Effect of pH and material ratio on the extraction of MT

響應(yīng)面是由測(cè)試因子和響應(yīng)值組成的三維立體曲面圖。它的等高線圖直觀地反映了變量之間相互作用的顯著程度。圓形表示雙因素相互作用不顯著且可以忽略,而橢圓表明這兩個(gè)因素具有顯著的相互作用。等高線越密集,因素變化對(duì)響應(yīng)值的影響越大。在同一橢圓區(qū)域中,響應(yīng)值在橢圓的中心點(diǎn)處是相同的,即從中心到邊緣遞減[18]。由圖5～圖10可知,響應(yīng)面開(kāi)口朝下,隨著每個(gè)因素的增大,響應(yīng)值增大,當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極大值后,隨每個(gè)因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小。該模型具有穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。AB、CD交互作用的等高線圖為橢圓形,說(shuō)明AB、CD的交互作用對(duì)MT含量有顯著影響,其他兩因素的等高線圖均為圓形或近圓形,說(shuō)明對(duì)MT含量的影響不顯著。

由Design-Expert8.0軟件分析,得出最優(yōu)提取條件為:提取液pH8.45,提取液濃度0.18 mol/L,提取溫度35 ℃,液料比為 6∶1。在實(shí)驗(yàn)可行范圍內(nèi)進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),提取液中MT提取含量均值為0.695 mg/g,MT提取模型的理論最佳值為0.702 mg/g,兩者之間差值為7 μg/g,測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,偏差不大,證明該結(jié)果合理可靠。兩者吻合度較高,說(shuō)明該模型可行,為毛蚶中MT的進(jìn)一步純化與研究提供技術(shù)支持。

3 討論與結(jié)論

圖8 提取液溫度和提取液濃度對(duì) MT 提取量效果的影響Fig.8 Effect of temperature and buffer concentration on the extraction of MT

圖9 提取溫度和液料比對(duì)MT提取量的影響Fig.9 Effect of temperature and material ratio on the extraction of MT

圖10 提取液濃度和液料比對(duì)MT提取效果的影響Fig.10 Effect of buffer concentration and material ratio on the extraction of MT

選取易于富集重金屬的毛蚶為提取原料,使用50 μmol/L氯化鋅誘導(dǎo)毛蚶體內(nèi)合成MT,誘導(dǎo)前后毛蚶組織Zn2+含量由0.0218 mg/g增加到0.0724 mg/g,MT含量由0.2917 mg/g增加為0.6503 mg/g,誘導(dǎo)效果顯著(P<0.05)。Zn2+增長(zhǎng)量為0.0506 mg/g,提取液中MT增長(zhǎng)量為0.258 mg/g,說(shuō)明在急性ZnCl2暴露過(guò)程中,毛蚶體內(nèi)快速合成MT,誘導(dǎo)效果顯著。本研究與本團(tuán)隊(duì)前期利用蝦夷扇內(nèi)臟提取金屬硫蛋白[6]相比,蝦夷扇貝內(nèi)臟是較好的提取制備MT的原料,雖然內(nèi)臟中MT含量較肌肉中多,但將蝦夷扇貝內(nèi)臟中MT含量與經(jīng)誘導(dǎo)后的毛蚶體內(nèi)MT含量相比,蝦夷扇貝內(nèi)臟中MT含量相對(duì)較低。而且毛蚶價(jià)格低,資源充足,經(jīng)誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)毛蚶體內(nèi)的MT含量要遠(yuǎn)高于蝦夷扇貝和褶牡蠣體內(nèi)[13]MT含量。所以,從性價(jià)比及MT提取含量?jī)煞矫婵紤],毛蚶可以作為提取金屬硫蛋白的理想原材料。研究表明,MT的α結(jié)構(gòu)域結(jié)合4個(gè)二價(jià)金屬離子,β結(jié)構(gòu)域結(jié)合3個(gè)二價(jià)金屬離子[19],低等的甲殼類如龍蝦無(wú)α域,只含兩個(gè)β域[20],貝類MT的結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道,但MT的進(jìn)化具有高度保守性。對(duì)于以毛蚶為原料提取MT,液料比、提取溫度及提取液pH對(duì)提取液中MT含量具有極顯著影響(P<0.01),故在后期工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)對(duì)這三種因素設(shè)置關(guān)鍵控制點(diǎn)。

經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn),以毛蚶為原料提取MT時(shí),先將毛蚶用Zn2+誘導(dǎo)暫養(yǎng)7 d,可大大提高其體內(nèi)MT的含量,實(shí)現(xiàn)高效提取。經(jīng)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)其最佳提取工藝為:提取液pH8.45,Tris-HCl提取液濃度0.18 mol/L,提取溫度35 ℃,液料比為6∶1。在實(shí)驗(yàn)可行范圍內(nèi)進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),提取液中MT提取含量均值為0.695 mg/g。本研究可為貝類加工企業(yè)充分合理利用加工下腳料提供一定參考,存在的缺點(diǎn)或不足之處在于,針對(duì)貝類內(nèi)臟團(tuán)極易富集重金屬的特點(diǎn),應(yīng)將內(nèi)臟團(tuán)和其他組織分離后各自提取MT,得到內(nèi)臟團(tuán)和其他組織中MT含量的數(shù)據(jù)。