刁立琴，康莉，付釗，高保栓，王亞茹

河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗研究院 （河北石家莊 050227）

殼聚糖創(chuàng)傷敷料是以殼聚糖為主材料制造成的一種生物產(chǎn)品，具有抑菌消炎、止血止痛、促進創(chuàng)面愈合、滋養(yǎng)修復黏膜、免疫調節(jié)活性的作用。殼聚糖創(chuàng)傷敷料作為一種新型的創(chuàng)傷敷料，已經(jīng)逐步取代傳統(tǒng)敷料，廣泛用于臨床創(chuàng)傷和傷口的愈合。

細胞毒性實驗是進行生物學評價的重要檢測指標。GB/T 16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》是最新的國家標準，其中MTT 法是目前常用的細胞毒性檢測方法。由于該標準僅規(guī)定了共性的實驗方法，并沒有明確規(guī)定如何選擇合理的樣品制備方法，因此，針對殼聚糖創(chuàng)傷敷料這類可溶性產(chǎn)品，本研究結合YY 0953-2016 《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》的行業(yè)標準，進行了一系列的對比實驗，以探討不同的樣品制備方法對殼聚糖創(chuàng)傷敷料細胞毒性實驗結果的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

材料：殼聚糖創(chuàng)傷敷料，陽性對照材料為20%的二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），陰性對照材料為高密度聚乙烯。

細胞：小鼠成纖維細胞L-929（中國科學院上海生命科學院細胞資源中心）。

主要試劑：1640培養(yǎng)基（北京Solarbio生物科技有限公司）；MEM培養(yǎng)基[賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd）；DMSO（SIGMA-ALDRICH）；異丙醇（天津市百世化工有限公司）；高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute，F(xiàn)DSC）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）；MTT（Sigma公司），溶于不含酚紅的MEM中，濃度為1 mg/ml，溶液采用過濾器（孔徑≤0.22 μm）經(jīng)無菌過濾法除菌，過濾后當天使用。

1.2 方法

材料浸提液制備（表1）：將樣品按不同的浸提介質和浸提比例分為1～4組，其中按6 cm2/ml 加入含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃浸提24 h 后作為浸提液1組；同法以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基和0.9%氯化鈉注射液制備浸提液2組和浸提液3組；每組設置100%浸提液和50%浸提液，分別標示為1a 組、1b 組、2a 組、2b 組和3a 組、3b 組[1]。將樣品按2 mg/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃浸提24 h 后作為浸提液4組[2]。

對照材料浸提液制備。陰性對照液：取高密度聚乙烯膜按表面積3 cm2/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM（1640或0.9%氯化鈉注射液）培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃浸提24 h。陽性對照液：20%的DMSO。

表1 浸提液制備分組

細胞毒性實驗方法：將1×105/ml 細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μl；置5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)液；加入樣品浸提液、空白對照液、陰性對照液和陽性對照液，每孔100 μl 置CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h；除去原培養(yǎng)液，每孔加入50 μl MTT 溶液；繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后除去孔內MTT 溶液，加入100 μl 異丙醇，振蕩10 min，在酶標儀570 nm 和650 nm 雙波長下測定吸光度（OD 值），按下式計算存活率：

存活率（%）=（100×OD570e）/ OD570b

注： OD570e為實驗樣品組（陰性、陽性對照組）吸光度平均值，OD570b為空白對照組吸光度平均值[3]。

2 結果

細胞存活率結果顯示，3a組（80%）＞1a組（69%）＞2a組（18%）；4組（93%）＞1a組（69%），表明殼聚糖創(chuàng)傷敷料在不同的浸提介質和浸提比例下，細胞毒性結果差異顯著，見表2～5。

表2 GB/T 16886.5-2017 MTT 法實驗結果（MEM 組，6 cm2/ml）

表3 GB/T 16886.5-2017 MTT 法實驗結果（1640組，6 cm2/ml）

表4 GB/T 16886.5-2017 MTT 法實驗結果（0.9%氯化鈉注射液組，6 cm2/ml）

表5 GB/T 16886.5-2017 MTT 法實驗結果（MEM 組，2 mg/ml）

3 討論

表2～4結果顯示，殼聚糖創(chuàng)傷敷料在其他方法相同，僅浸提介質不同的情況下，細胞存活率結果出現(xiàn)顯著差異，0.9%氯化鈉注射液組＞MEM 組＞1640組。我們分析認為，殼聚糖創(chuàng)傷敷料在3種浸提介質中都能很好地溶解，0.9%氯化鈉注射液的成分相對單一，而1640和MEM 中含有多種氨基酸和葡萄糖等，成分相對復雜，在和樣品浸提的過程中，可能因不同成分和樣品相互作用，甚至發(fā)生反應，導致最終的浸提液差異，因此，不能簡單以細胞存活率的高低來判定哪種浸提介質是適宜的，應結合臨床實際應用，模擬創(chuàng)面體液環(huán)境，才能保證評價結果的臨床預期。

表2～5結果顯示，浸提介質均選擇含10%胎牛血清的MEM，按2 mg/ml 浸提比例的細胞存活率結果明顯高于按6 cm2/ml 浸提比例的結果。按GB/T 16886.12-2017中規(guī)定選用面積比，根據(jù)產(chǎn)品厚度＜0.5 mm，選擇6 cm2/ml；同時，YY 0953-2016標準中6.18.2規(guī)定，可用0.9%氯化鈉注射液配制成含羧甲基殼聚糖2 mg/ml 溶液作為實驗液。對比2 mg/ml 和6 cm2/ml 浸提比例，按質量/體積同等換算為面積/體積比，浸提液相當于稀釋了8倍，雖然得到的細胞存活率結果較高，但是否與實際應用一致有待考證。

GB/T 16886.12-2017中規(guī)定，有質量比為0.2 g/ml 和0.1 g/ml 兩種浸提比例。但是，對于殼聚糖創(chuàng)傷敷料這種可溶性產(chǎn)品，這兩種浸提比都難以使產(chǎn)品充分溶解，無法獲取浸提液，顯然這兩種浸提方法都不適用此類產(chǎn)品，因此，從臨床應用情況考慮，我們認為采用面積比更加貼合實際。

實驗樣品的前期制備對結果起著關鍵作用。GB/T 16886.12-2017雖然給出了樣品制備的原則，卻是對醫(yī)療器械的通用要求，針對具體品種，需要實驗者或者企業(yè)自己選擇。從本研究結果可知，對于殼聚糖創(chuàng)傷敷料這類產(chǎn)品，不同的樣品制備方法在同一實驗室內結果差異顯著，而且針對其可溶性這類特性，因為沒有統(tǒng)一的制備方法，即使相同的產(chǎn)品在不同的實驗室間也會出現(xiàn)很大差異，這不僅不利于國家對同類產(chǎn)品的監(jiān)管評判，也對現(xiàn)有的標準方法提出了挑戰(zhàn)。隨著市場上醫(yī)療器械產(chǎn)品日益豐富，材質特性日益多元化，我們認為，有必要根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品特性，制定相關的產(chǎn)品標準，才能保障產(chǎn)品的安全有效。