楊楷 鄭宏斌 黃鶯 馮新維 明堂

摘?要：試驗(yàn)采用土培方式，設(shè)置5個(gè)氮素水平來(lái)研究不同施氮量對(duì)烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明：施氮量在一定范圍內(nèi)對(duì)烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性均有促進(jìn)作用，但過(guò)高則產(chǎn)生抑制，且不同酶、不同生育時(shí)期的作用濃度并不相同。移栽后7d，煙葉硝酸還原酶活性（NRa）隨施氮量的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，施氮量≤5.45g/株時(shí)，增施氮肥可促進(jìn)NRa，有利于NO.-3向NH3的轉(zhuǎn)化;>5.45g/株時(shí)，則因反應(yīng)產(chǎn)物NO.-2或NH.+4濃度的增加抑制了NRa;煙葉谷氨酰胺合成酶活性（GSa）在旺長(zhǎng)期和現(xiàn)蕾期時(shí)均隨施氮量的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，且GSa分別在5.45g/株、8.18g/株施氮量下達(dá)到最大值5.777U/g、18.713U/g，施氮量≤10.91g/株條件下增施氮肥可促進(jìn)谷氨酸含成酶（GOGATa），≥10.91g/株時(shí)，則因Glu濃度過(guò)高抑制GOGATa。

關(guān)鍵詞：烤煙;施氮量;酶活性

中圖分類號(hào)：S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2020）03-0075-05?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.013

Effect of Nitrogen Application on the Activity of Key Enzymes in Nitrogen Metabolism of Flue-Cured Tobacco

YANG Kai .1，3，ZHENG Hongbin.2，HUANG Ying .1，3*， FENG Xinwei .1，3， MING Tang .1

（1.College of Tobacoo Science，Guizhou University， Guiyang，Guizhou 550025，China;2.China Tobacco Zhejiang Industrial Co，Ltd.，Hangzhou，Zhejiang 310000，China;3. Key Laboratory of Tobacco Quality Research of Guizhou Province， Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：In order to explore the effects of different nitrogen application on the key enzyme activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco， five nitrogen levels were used to study the effects of different application amount of nitrogen on the key enzyme activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco by soil culture method. The results showed that the application amount of nitrogen could promote the activity of key enzymes in nitrogen metabolism of flue-cured tobacco within a certain range， but higher amount would produce inhibition effect， and the effect concentrations varied in different enzymes and different growth periods. Seven days after transplanting， NRa of tobacco increased first and then decreased with the increase of nitrogen application. When nitrogen application was ≤5.45g/plant， the additional application of nitrogen could promote NRa， which was beneficial to the conversion of NO.-3 to NH3. When it was >5.45g/plant，NRa was inhibited because of increasing the concentration of NO.-2 or NH.+4. The GSa increased first and then decreased with the increase of nitrogen application during the prosperous period and the bud stage， and that reached the maximum value of 5.777U/g， 18.713U/g under the treatments of 5.45g/plant， 8.18g/plant respectively. The increase of nitrogen application under the condition of nitrogen application ≤10.91g/plant could promote GOGATa.When it was ≥10.91g/plant，GOGATa was inhibited due to excessive Glu concentration.

Keywords：flue-cured tobacco; nitrogen application amount; enzyme activity

氮代謝是煙草最基本、最重要的代謝之一，其代謝強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度及在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化動(dòng)態(tài)對(duì)煙葉品質(zhì)形成具有重要影響[1-2]。外源氮濃度對(duì)烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性有著重要影響，據(jù)岳紅賓[3]、許晨曦[4]等報(bào)道，隨著外源氮素水平的提高，葉片中硝酸還原酶（NR）的活性（NRa）有上升趨勢(shì)，但王紅麗等[5]則認(rèn)為，NR基因的表達(dá)量在不同供氮水平間并無(wú)明顯差異。何文高[6]研究表明，提高施氮量對(duì)煙葉中谷氨酰胺合成酶活性（GSa）起到促進(jìn)作用;曾孝敏[7]的研究表明，隨著施氮量的增加，谷氨酸合成酶GOGATa增加，ANDREA等[8]研究認(rèn)為，谷氨酰胺或天冬酰胺的體內(nèi)積累對(duì)NR基因表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。由此可見(jiàn)，烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性不僅受氮濃度的誘導(dǎo)，還受到產(chǎn)物濃度的制約[9]。氮代謝產(chǎn)物過(guò)少或超量積累均不利于烤煙優(yōu)良品質(zhì)的形成，目前雖有研究表明氮代謝產(chǎn)物對(duì)NR的代謝過(guò)程進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，但對(duì)氮代謝銨同化的反饋調(diào)節(jié)、施氮量對(duì)不同氮代謝產(chǎn)物影響的關(guān)聯(lián)性等少見(jiàn)報(bào)道。

為此，通過(guò)對(duì)不同施氮量下烤煙不同生育時(shí)期氮代謝關(guān)鍵酶（NR、GS、GOGAT）活性的測(cè)定，進(jìn)一步探討烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性在不同施氮水平下的變化規(guī)律，以期為烤煙的氮代謝調(diào)控提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于 2018 年在安順平壩貴州大學(xué)-安順煙草研究基地溫室中進(jìn)行。烤煙品種為云煙87。供試土壤為黃泥土，其基本理化性狀見(jiàn)表1。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用土培試驗(yàn)，設(shè)置5個(gè)N肥施用水平（以N計(jì)），分別是T1：0g/株;T2：5.45g/株;T3：8.18g/株;T4：10.91g/株;T5：13.64g/株，設(shè)置3次重復(fù)。

土培用紫砂盆缽（30cm×35cm），將風(fēng)干過(guò)2mm篩的土壤12.5kg與烤煙專用復(fù)合肥（N：P2O5：K2O=10：11：12）混合后裝入，待煙苗四葉一心時(shí)，選取健壯均勻長(zhǎng)相一致的進(jìn)行移栽，每盆1株。團(tuán)棵時(shí)再培土2.5kg/盆，同時(shí)施入追肥。供試肥料包括基肥與追肥，基肥在裝土?xí)r施入，追肥在團(tuán)棵期施入?；手械租浄室钥緹煆?fù)合肥形式提供，追肥中氮肥、鉀肥以烤煙追肥（N：P2O5：K2O=13：0：26）形式提供，其中，氮、磷、鉀不足處理分別用尿素、普鈣、硫酸鉀補(bǔ)足。肥料用量按田間施用量折算為單株施用量（種植密度1100株/667m.2），即氮肥施用量按設(shè)計(jì)方案施用，磷肥全部用作基肥，施用量為（以P2O5計(jì)）5.00g/株，鉀肥施用量為14.45g/株（以K2O計(jì)）。

1.3?測(cè)定方法及儀器

于移栽后7d（伸根期）、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期選取煙株中部葉進(jìn)行酶活性測(cè)定。主要儀器：酶標(biāo)儀（Bio Tek EON） 。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.4?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，利用DPS V7.05統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?施氮量對(duì)煙葉硝酸還原酶活性的影響

因伸根期煙葉樣品較少，故該期樣品為三次重復(fù)的煙葉混合樣品。從圖1可知，在烤煙移栽后7d，煙葉NRa隨施氮量的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì);此時(shí)烤煙對(duì)氮的需求較小，施氮量≤5.45g/株時(shí)，增施氮肥可促進(jìn)NRa，當(dāng)高于5.45g/株時(shí)，可能是由于反應(yīng)產(chǎn)物NO.-2或NH.+4濃度的增加抑制了NRa。旺長(zhǎng)期，NRa隨施氮量的增加而增加，不施氮（T1）處理顯著低于其他各處理，施氮處理間差異不顯著，可能因?yàn)榇藭r(shí)烤煙對(duì)氮素的吸收同化能力增強(qiáng)，反應(yīng)產(chǎn)物NO.-2或NH.+4濃度雖隨著施氮量的增加有所上升，但未對(duì)NRa形成抑制?，F(xiàn)蕾期，NRa的變化在各施氮水平之間與移栽后7d相似，在施氮量≤8.18g/株范圍內(nèi)，不施氮處理在移栽后7d與T2、T3處理差異不大，而在現(xiàn)蕾期時(shí)則顯著低于其他處理，可能是因?yàn)楝F(xiàn)蕾期烤煙對(duì)氮的吸收量遠(yuǎn)大于土壤的氮素供應(yīng)量，而在移栽后7d兩者則較為接近，高于8.18g/株時(shí)，T4、T5處理NRa均受到反應(yīng)產(chǎn)物NO.-2或NH.+4的抑制，但現(xiàn)蕾期的抑制作用低于移栽后7d，可能是此時(shí)烤煙對(duì)氮的吸收同化能力增強(qiáng)所致，對(duì)氮素的需求量較大，因此生產(chǎn)上施肥可適當(dāng)提高基追比以滿足烤煙對(duì)氮素吸收利用的要求。

2.2?施氮量對(duì)煙葉谷氨酰胺合成酶活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）是處于氮代謝中心的多功能酶，具有轉(zhuǎn)化酶和合成酶兩種酶活性，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)。GS對(duì)NH.+4的高親和力，使GS成為植物體內(nèi)氨同化的主要途徑[11]。從圖2可知，移栽后7d，煙葉GSa隨施氮量的增加而降低，可能是此時(shí)大量的NH.+4促使GS將其合成為谷氨酰胺（Gln），而Gln濃度增加抑制了GSa;在烤煙旺長(zhǎng)期和現(xiàn)蕾期，煙葉GSa隨生育時(shí)期的推進(jìn)而增加，隨施氮量的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，且GSa分別在T2、T3處理時(shí)達(dá)到最大值為5.777U/g、18.713U/g，不施氮（T1）處理在旺長(zhǎng)期時(shí)顯著高于T5處理，與T3、T4處理間差異不顯著，而在現(xiàn)蕾期則顯著低于其他各處理，可能是烤煙對(duì)NH.+4的同化能力隨生育時(shí)期的推進(jìn)而增強(qiáng)，當(dāng)?shù)毓?yīng)量過(guò)多時(shí)，現(xiàn)蕾期T4、T5處理的代謝產(chǎn)物Gln對(duì)GSa的抑制作用較旺長(zhǎng)期時(shí)低。

2.3?施氮量對(duì)煙葉谷氨酸合成酶活性的影響

谷氨酸合成酶（GOGAT）是植物體內(nèi)氮素同化與循環(huán)的關(guān)鍵酶，也是GS/GOGAT循環(huán)過(guò)程中的限速酶，在氮同化途徑中，催化Gln與α-酮戊二酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔℅lu）。從圖3可知，各處理煙葉GOGATa在整個(gè)生育期均隨施氮量的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，移栽后7d，T2處理煙葉GOGATa最高，T5處理最低;烤煙旺長(zhǎng)期，不施氮（T1）處理GOGATa顯著低于T4處理，其余處理間差異不顯著，在施氮量≤10.91g/株范圍內(nèi)，增施氮肥可促進(jìn)GOGATa，可能是此時(shí)氮代謝產(chǎn)物Gln濃度增加促進(jìn)GOGAT將Gln進(jìn)一步同化為Glu，而高于10.91g/株時(shí)，則因Glu濃度過(guò)高抑制了GOGATa;在現(xiàn)蕾期時(shí)，GOGATa在T2處理時(shí)達(dá)到最大值為140.291nmol·min·g，而T5處理GOGATa顯著低于其他各處理，且T2與T4、T5間均達(dá)到顯著性差異，可能是此時(shí)烤煙氮代謝強(qiáng)度減弱，對(duì)Gln的同化能力下降，因此T5處理的代謝產(chǎn)物Glu對(duì)GOGATa的抑制作用相對(duì)于旺長(zhǎng)期時(shí)較強(qiáng)。

3?結(jié)論與討論

氮代謝包括無(wú)機(jī)氮（硝態(tài)氮） 的還原、同化，以及有機(jī)含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成等過(guò)程。酶作為煙草體內(nèi)進(jìn)行各種生物化學(xué)反應(yīng)的最重要物質(zhì)，催化煙草體內(nèi)各種生理生化代謝過(guò)程的進(jìn)行。NR是氮代謝途徑的關(guān)鍵酶與限速酶，也是煙草氮同化的最初反應(yīng)催化者[12]，可調(diào)節(jié)NO.-3的還原，從而調(diào)節(jié)氮代謝[13]。

硝酸還原酶作為氮代謝過(guò)程的第一個(gè)酶，其活性較低，對(duì)外部條件敏感，較不穩(wěn)定，所以硝酸還原酶的活力對(duì)硝酸還原有一定的限制作用，其活性強(qiáng)弱會(huì)直接影響氮代謝能力的高低[14]。本研究移栽后7d，施氮量低于5.45g/株時(shí)，NRa隨施氮量的增加而增加，當(dāng)施氮量高于5.45g/株時(shí)，可能受到反應(yīng)產(chǎn)物NO.-2或NH.+4濃度增加的抑制，NRa開(kāi)始下降;除不施肥（T1）處理外，現(xiàn)蕾期各施氮處理NRa均高于移栽后7d，可能是現(xiàn)蕾期烤煙對(duì)氮的吸收同化能力增強(qiáng)[15]，致使煙株體內(nèi)的氮代謝產(chǎn)物NO.-2或NH.+4濃度降低，對(duì)NRa的抑制作用低于移栽后7d，這與凡聰?shù)萚16]的研究結(jié)果一致。

植物 NH.+4的同化是通過(guò)GS與GOGAT協(xié)同配合構(gòu)成的 GS /GOGAT 循環(huán)進(jìn)行的[17]。在氮素同化過(guò)程中，GS將NH.+4同化形成谷氨酰胺，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成谷氨酸，形成氨基酸，進(jìn)而形成不同的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)化成含氮堿等含氮化合物[18];GOGAT催化谷氨酰胺-N結(jié)合到α-酮戊二酸的α-酮基上生成谷氨酸，高等植物95%以上的NH.+4通過(guò)GS/GOGAT循環(huán)同化，GOGAT是該途徑的限速酶[19-20]。本研究結(jié)果表明：移栽后7d，由于GSa在較低供氮水平下仍維持在較高水平，故煙株體內(nèi)有大量的NH.+4生成，大量的NH.+4促使GS將其合成為Gln，而Gln濃度增加反而抑制了GSa，因此GSa隨施氮量的增加而下降。而王紅麗等[21]認(rèn)為，GS基因的表達(dá)量在煙葉進(jìn)入成熟期前隨施氮量的增加而增強(qiáng)，這可能與試驗(yàn)設(shè)置的氮濃度水平較低有關(guān)。在烤煙旺長(zhǎng)期和現(xiàn)蕾期，GSa與GOGATa均隨施氮量的增加先增加后降低，說(shuō)明此時(shí)氮代謝產(chǎn)物Gln濃度較高，在施氮量5.45g/株范圍內(nèi)，氮代謝產(chǎn)物Gln的濃度增加，促進(jìn)GOGATa增加的同時(shí)對(duì)GSa產(chǎn)生了抑制作用，而高于5.45g/株時(shí)，GOGATa受到代謝產(chǎn)物Glu濃度增加的抑制，因此其活性降低。各處理煙葉GSa均在現(xiàn)蕾期時(shí)達(dá)到最大，與葛國(guó)鋒等[22]研究結(jié)果一致，說(shuō)明烤煙對(duì)NH.+4的同化能力隨生育時(shí)期的推進(jìn)而增強(qiáng)。當(dāng)?shù)毓?yīng)量高于8.18g/株時(shí)，增施氮肥反而降低GSa，且現(xiàn)蕾期T4、T5處理的代謝產(chǎn)物Gln對(duì)GSa的抑制作用相對(duì)于旺長(zhǎng)期時(shí)較低，這一點(diǎn)可從各施氮處理間GOGATa在旺長(zhǎng)期時(shí)差異不顯著和在現(xiàn)蕾期時(shí)T5處理顯著低于其他各處理得到驗(yàn)證。

在試驗(yàn)設(shè)置的氮濃度水平下，在一定施氮量范圍內(nèi)氮濃度對(duì)NR、GS、GOGAT等酶活性均有促進(jìn)作用，但在較高氮水平下反而抑制酶活性。在烤煙生育前期，施氮量對(duì)NR和GS的影響具有較高的一致性，即最高施用量為5.45g/株，隨著生育期的推進(jìn)，NRa隨施氮量的提高而增加，GS仍在高于5.45g/株后受抑制，這一方面說(shuō)明烤煙生育后期氮代謝強(qiáng)度逐漸減弱，同時(shí)過(guò)多的氮素供應(yīng)會(huì)通過(guò)GS得以調(diào)控。施氮量對(duì)GOGAT的影響與NR、GS有較大差異，其抑制效應(yīng)在高于8.18g/株時(shí)才會(huì)顯現(xiàn)，這可能是因?yàn)镚la并不是Gln唯一的代謝產(chǎn)物所致。

綜上所述，煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性不僅受到氮用量的調(diào)控，還受到相應(yīng)的氮代謝產(chǎn)物濃度的制約，并且不同酶活性對(duì)氮用量的響應(yīng)是有差異的。

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