管媛媛，楊婷，葛雨嘉，黃靜

(華東師范大學 生命科學學院，上海，200241)

淀粉是人體生命活動能量的重要來源，其中的葡萄糖分子由α-1,4-糖苷鍵與α-1,6-糖苷鍵連接。淀粉來源不同，其直鏈與支鏈的比例也不同，這直接影響著淀粉的顆粒形式、結晶度[1]及功能。根據在小腸中消化的難易程度(基于水解時間)，可將淀粉分為快速消化淀粉(rapidly digestible starch, RDS)、緩慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)和抗性淀粉(resistant starch, RS)。RDS的攝入可引起血糖及胰島素水平的迅速提高，已有研究證明該過程可能是引起 Ⅱ 型糖尿病和肥胖癥的原因之一[2]；相比之下，富含SDS及RS的食物可在維持飽腹感的同時，緩慢地為機體釋放能量，具有調節(jié)血糖、降低血脂、促進礦物質吸收和保護腸道等功能，因而被認為是膳食纖維的一種。由于α-1,6-糖苷鍵的水解速率低于α-1,4-糖苷鍵的水解速率，可導致淀粉體外消化速率變慢，所以增加分支密度是提高淀粉慢消化性能的策略之一[3]。

經物理改性、化學改性、生物改性(酶法改性)等方式改性處理后，天然淀粉分子重排生成簇狀結構，消化速率降低，慢消化性能提高[4]。其中，使用淀粉分支酶的生物改性方法因反應條件溫和、底物特異性強、得到的產物安全無污染等優(yōu)點而得到青睞。但天然存在的SBE存在酶活低、成本高、處理量小、難以工業(yè)化等問題，因此利用基因工程技術開發(fā)經濟實惠、高效的生物酶產品的研究亟待進行。目前SBE已在多種系統(tǒng)中成功異源表達。本文著重分析了近年來有關實現微生物來源的SBE在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌中重組表達策略的研究進展，概述了這2種表達系統(tǒng)作為SBE生產工具的適用性特征，并討論了SBE異源表達工程的未來前景。

1 淀粉分支酶概述

1.1 淀粉分支酶作用機理及來源

淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE， EC 2.4.1.18)，又名1,4-α-葡聚糖分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme, GBE)，是一種集水解、轉移、合成為一體的糖基轉移酶[5]。SBE含有α-淀粉酶家族共有的三大結構域，即氨基末端α-夾心結構、羧基末端結構域和活性中心α/β桶域[6]，主要通過鏈間轉移、鏈內轉移和環(huán)化反應3種催化方式與底物發(fā)生作用(圖1)。對SBE一級序列的分析表明，大部分SBE屬于糖苷水解酶家族GH13(glycoside hydrolase family 13)，能同時作用于支鏈淀粉和直鏈淀粉[7]；少部分屬于糖苷水解酶家族GH57，僅作用于直鏈淀粉[8]。其機理是通過內部α-1,4-糖苷鍵的水解和釋放，將切下的非還原末端轉移至受體鏈C-6羥基，在α-葡聚糖中產生α-1,6-糖苷鍵，使得淀粉直鏈縮短、支化程度增加，得到新型改性淀粉[7]。

圖1 淀粉分支酶作用機理(改編[9])

在動物、植物、細菌、真菌等多種生物編碼的SBE中，微生物來源SBE的最適反應溫度較高、特異性強、分支化度大、催化方式簡單，且易于基因操作，在工業(yè)應用中具有特殊優(yōu)勢。目前已經在超嗜熱細菌Aquifexaeolicus[10]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[11]、Thermomonosporacurvata[12]等微生物中發(fā)現了編碼SBE的基因。但微生物來源SBE通常是胞內酶，天然產物的原始產生菌具有產量低等缺點，這使得利用基因工程技術實現該酶的異源表達具有重大意義。

1.2 淀粉分支酶的應用研究現狀

近年來，對于改性淀粉的研究越來越成為食品工業(yè)中的熱點。已有研究表明，經SBE改性后的淀粉，其穩(wěn)定性和支化程度提高、抗回生特性增強、慢消化性能得到明顯改善[13]，符合消費者對營養(yǎng)健康的需求。改性淀粉可以作為糖尿病以及肥胖病患者的功能性食品；也可以作為運動飲料的一種成分，因其優(yōu)良的慢消化性能而維持運動員較長時間的血糖供應[14]。除食品工業(yè)外，改性淀粉在醫(yī)藥、水處理、造紙工業(yè)、包裝材料等領域都被廣泛應用，在工業(yè)生產中具有重要的意義。

獲得SBE一般通過分離純化天然產物、化學合成和基因工程技術等途徑。而野生菌株產生分支酶能力較低，需要對產酶條件進行優(yōu)化，才能到達較高的產酶水平；化學合成及下游純化工藝復雜，副產物多，且研發(fā)和生產成本高；相比之下，通過基因工程技術途徑獲得SBE更簡便，成本更低，效果更好。目前多種微生物來源的SBE已在細菌等系統(tǒng)中成功重組表達，在國外生產出了一系列用于工業(yè)淀粉加工的產品。來自Bacillusstearothermophilus的SBE經Bacillussubtilis異源表達[11]，實現了商業(yè)化，可在食品中利用[15]；其作用的產物——高度支化環(huán)狀糊精(highly branched cyclic dextrin，HBCD)[16]也是商業(yè)產品。此外，還有諾維信公司商業(yè)化Branchzyme等。但目前國內囿于技術限制，仍未出現商業(yè)化SBE產品，采取各種有效手段，打破技術壁壘是SBE高效表達研究的重要意義。

為了提高目的基因的表達量有幾種較常用的手段，如在基因水平上，可以通過提高外源基因的轉錄水平，即篩選高效啟動子及優(yōu)化核糖體結合位點來提高表達水平；另外表達載體在細胞中的拷貝數和穩(wěn)定性對外源基因的表達也有明顯影響。在蛋白水平上，要分析掌握外源基因在表達系統(tǒng)中的遺傳穩(wěn)定性及不同生物來源的基因在表達系統(tǒng)中表達后加工和修飾的情況。基于淀粉加工用酶基因家族(如α-淀粉酶、普魯蘭酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶、海藻糖合成酶等)異源表達的成功經驗對SBE的異源表達進行優(yōu)化是目前國內工作的重點，SBE在微生物中的異源高效表達策略的研究仍有許多工作等待完成。

2 淀粉分支酶在大腸桿菌的表達策略

目前，研究者已經利用大腸桿菌為宿主表達了大量不同微生物來源的SBE，如Geobacillusthermoglucosidan[17]、Geobacillusmahadia[18]等。大腸桿菌表達系統(tǒng)遺傳背景清晰、操作手段成熟、繁殖周期短、生產費用低、產量高，應用范圍十分廣泛。但大腸桿菌表達系統(tǒng)也存在一定的缺陷，據文獻報道，絕大多數微生物來源的SBE都是胞內酶，大腸桿菌無法進行蛋白質轉錄后的修飾，同時大腸桿菌胞質內還原性環(huán)境不利于正確的次級鍵的形成，部分重組蛋白易形成不溶于水的包涵體。因此，可綜合采用多種策略實現SBE在大腸桿菌中的過量表達。

2.1 宿主選擇

表達宿主顯著影響著外源基因表達產物的表達量及表達活性。以蛋白酶缺陷的大腸桿菌作為宿主，能有效解決外源蛋白在宿主細胞中表達時易被宿主來源蛋白酶降解的問題，促使外源可溶蛋白和分泌表達的蛋白積累量提高。其中，最經典的蛋白酶缺陷型菌株就是BL21系列菌株，為T7表達系統(tǒng)而設計的BL21(DE3)是其中研究最成熟的表達宿主[19]。

鮑春輝等[20]將來源于GeobacillusthermoglucosidansSTB02的SBE基因插入質粒pET-20b(+)的T7啟動子序列下游，構建了表達載體pET-20b(+)/sbe，轉化至宿主大腸桿菌BL21(DE3)，經超聲后產生的SBE總酶活最高為222.4 U/mL。范琴等[21]將來源于Thermomonosporacurvata的SBE基因(TcSBE)重組至pET-22b(+)，構建重組大腸桿菌BL21(pET-22b(+)-TcSBE)，實現了TcSBE的過量表達，目標分支酶活達90.28 U/mg。LI等[22]從創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)中篩選出糖原分支酶，構建pET-15b(+)/vvgbe重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，酶活達53.33 U/mL。以上研究均表明，蛋白酶缺陷型的大腸桿菌菌株是SBE異源表達的理想宿主菌株。

2.2 密碼子偏愛性改造

重組蛋白在異源表達系統(tǒng)中的表達可能受密碼子利用的影響。大腸桿菌中密碼子的使用頻率與原宿主細胞存在差異，且缺乏某些種類的tRNA，由此造成翻譯困難或效率低下。密碼子偏愛性(CUB)和mRNA結構穩(wěn)定性是mRNA的重要內在特征，與mRNA表達水平呈正相關[23]，將目的基因中部分堿基替換，使稀有密碼子同義替換為大腸桿菌的偏愛密碼子，可以得到表達量顯著提高的基因型。

LIU等[24]利用系統(tǒng)密碼子優(yōu)化的方法，對來源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的野生α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶基因的密碼子進行優(yōu)化，并在BL21(DE3)中表達，合成基因菌株的蛋白質量濃度比原始基因菌株(1 710 mg/L)提高了2 520 mg/L，胞外酶活達55.3 U/mL。張曉元等[25]對海藻糖合成酶tres基因進行密碼子優(yōu)化，得基因tres1，分析表明，含pET-26b(+)-tres1表達載體的大腸桿菌海藻糖合成酶活性比含pET-26b(+)-tres的工程菌高60.3%以上。目的基因是表達載體上的重要結構，淀粉加工用酶基因的成功實踐表明密碼子偏愛性改造可能有利于外源SBE基因在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達。

2.3 促進外源蛋白高效可溶性表達

在目的基因獲取、載體建立等操作的基礎上，對目的基因進行表達檢測也是異源表達的重要環(huán)節(jié)，大腸桿菌的培養(yǎng)環(huán)境將顯著影響外源蛋白在其中的表達。因此，需要采取適宜的培養(yǎng)條件，促進SBE在大腸桿菌中的高效可溶性表達，防止其以包涵體的形式積累。

2.3.1 誘導條件優(yōu)化

一般而言，組成型啟動子具有穩(wěn)定的基因表達水平，誘導型啟動子僅在特定條件下發(fā)揮功能。在菌體生長對數早期誘導，菌體量較少，表達受到限制；在對數生長末期進行誘導，營養(yǎng)的消耗及代謝產物的積累使菌體生長受到抑制，表達量下降。誘導劑濃度過低可能導致低效誘導，而濃度過高會產生毒性效應，也可能導致重組蛋白在包涵體中的積累[26]。因此，在大腸桿菌中使用誘導性啟動子表達可溶性外源蛋白時，必須嚴格控制誘導的時間和誘導劑的濃度，以使重組蛋白高效表達。

鮑春輝等[20]選擇TB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)現在誘導溫度25 ℃下，誘導時間為培養(yǎng)12 h后，誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside，IPTG)濃度為0.01 mmol/L時，菌體超聲破壁后產生的SBE總酶活達到最高。劉藝婷[27]在BL21(DE3)中表達來源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌的SBE，證實了在其他培養(yǎng)條件一定時，誘導劑IPTG濃度為0.005 mmol/L最有利于SBE的胞外生產。KO等[28]使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析表明，在一系列梯度條件中，37 ℃下培養(yǎng)表達SBE的大腸桿菌直至OD600nm達到0.6時，用0.2 mmol/L IPTG誘導5 h，可獲得最高總酶活。

2.3.2 發(fā)酵參數及培養(yǎng)基優(yōu)化

大腸桿菌可以在簡單又廉價的培養(yǎng)基上生長并達到高細胞濃度，通過選擇發(fā)酵參數，如溫度、時間、pH、接種量等，輔以改善培養(yǎng)基的組成，優(yōu)化發(fā)酵工藝，可以達到提高發(fā)酵產率的目的。

DER MAAREL等[29]在大腸桿菌中過表達了來自Aquifexaeolicus的SBE，并報道了其一些基本特性，發(fā)現大多數酶存在于包涵體中。大腸桿菌生長的適宜溫度為37～39 ℃，但較高的溫度易導致可溶性外源蛋白生成包涵體，使表達受阻，低溫培養(yǎng)能有效增加可溶性外源蛋白的表達[19]。李陽等[30]通過多階段溫度控制策略提高重組大腸桿菌產SBE的胞外酶活，在無需菌體破壁的情況下獲得了較高的胞外酶活(48.2 U/mL)。鮑春輝等[20]以能胞內表達SBE的重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-20b(+)/be)為研究對象，對搖瓶發(fā)酵條件如最適發(fā)酵培養(yǎng)基、初始pH、發(fā)酵溫度等進行了優(yōu)化，得到SBE總酶活最高為222.4 U/mL。多階段溫度控制策略是提高大腸桿菌可溶性表達外源蛋白的有效舉措，在此基礎上使用培養(yǎng)基優(yōu)化等基礎手段，可以達到高效表達SBE的目的。

2.3.3 使用表面活性劑

外源蛋白在大腸桿菌內表達過程中容易被宿主細胞蛋白酶降解或形成包涵體，表面活性劑可能使大腸桿菌細胞內外膜滲透性增加，有助于加強蛋白分泌，但更加具體的機理尚不清楚。

成成等[31]研究了不同濃度表面活性劑Tween-80、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)等對大腸桿菌生產α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的影響，結果表明，相比未添加表面活性劑時，最終胞外酶活分別提高了4.6和12.67倍。鄒純[32]在培養(yǎng)基中添加Tween-80、Triton X-100、SDS等表面活性劑，探究其對大腸桿菌胞外分泌普魯蘭酶的影響。其中添加Triton X-100可使大腸桿菌產生最大總酶活，為對照組的1.45倍。目前，添加表面活性劑已在某些重組淀粉加工用酶異源表達活性提高的研究中得到了有效應用，在SBE的效果仍待探索。

3 淀粉分支酶在枯草芽孢桿菌中的表達策略

枯草芽孢桿菌由于其非致病性，分泌可溶性蛋白質的強大能力以及良好的發(fā)酵基礎和生產技術，成為原核表達系統(tǒng)中外源蛋白表達和分泌的理想宿主[33]，是認證的食品安全微生物(generally recognized as safe, GRAS)。CHOI等[11]對從表達SBE的枯草芽孢桿菌中獲得的發(fā)酵產物BE-01和BE-02進行了標準的毒理學測試，證實了二者在食品生產中的安全性。一般來說，枯草芽孢桿菌分泌異源蛋白質的能力較低，為了克服這個問題，研究者采取了各種手段，如使用強啟動子、酶分子定向進化等。目前，SBE在枯草芽孢桿菌中雖已成功異源表達，但表達量及酶活均較低。

3.1 使用啟動子多拷貝序列

多拷貝策略通過提高基因拷貝數來提高目的蛋白表達量，是實現蛋白質更高效表達的途徑。多拷貝策略主要分為表達盒多拷貝、目的基因多拷貝、啟動子多拷貝等。相比于表達盒和目的基因，啟動子僅有20～100 bp的長度，在多拷貝的過程中不會過多地增加宿主細胞的負擔[34]。

由于單個啟動子提供的核糖核酸聚合酶(ribonucleic acid polymerase，RNAP)的結合位點較少，即使使用一個強啟動子來指導重組蛋白的合成，該產品的產率可能依舊較低[35]。設計多啟動子表達系統(tǒng)，組合使用多個啟動子控制同一基因的轉錄，是提高重組蛋白產量的一種很有前途的方法。

ZHANG等[36]研究出的雙啟動子PHpaII-PamyQ系統(tǒng)不僅在胞外α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的產生中表現出最好的性能，而且還可以高效介導胞外普魯蘭酶和α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的合成，這表明了該系統(tǒng)的普遍適用性。KANG等[37]在PHpaII啟動子下游串聯(lián)一個組成型啟動子(枯草芽孢桿菌NA64的amyR2啟動子或地衣芽孢桿菌的blma啟動子)，用以表達4-α-糖基轉移酶，與含單個PHpaII的枯草芽孢桿菌系統(tǒng)相比，含串聯(lián)啟動子的表達系統(tǒng)目的產物的產量分別提高11和12倍。SONG等[38]通過評估涉及不同啟動子(PHpaII和P43)和宿主組合的各種表達系統(tǒng)，優(yōu)化了調控元件和宿主菌株，最終重組枯草芽孢桿菌支鏈淀粉酶的表達水平達到初始的6.28倍。

目前多個相同或不同啟動子串聯(lián)提高異源蛋白表達量策略已在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中得到了相關應用，本實驗室將3個Pgrac啟動子串聯(lián)用以介導SBE的生產，重組枯草芽孢桿菌SBE表達水平為初始的1.5倍。隨著越來越多啟動子元件的識別和功能表征，可以更合理地對單個啟動子序列進行串聯(lián)，從而減少實驗的盲目性和后續(xù)篩選過程的工作量。

3.2 外源蛋白基因改造

3.2.1 隨機突變

在蛋白質基因中引進隨機突變通常是蛋白質功能進化的有效策略，如采用物理誘變、化學誘變等多種方式，使含目的基因的質粒發(fā)生突變，轉化受體菌獲得突變體；或采用易錯PCR技術向基因中引入隨機突變等。在已有經驗的基礎上，本實驗室運用體外分子進化的策略，使用NaNO2誘變獲取突變質粒并轉化枯草芽孢桿菌受體菌，進一步篩選最終獲得1株SBE高產菌株，酶活性為出發(fā)菌株的10倍。

3.2.2 定點突變

通過在DNA水平上的堿基替換改變蛋白質特定位點的氨基酸序列，稱為基因的定點突變，可以有目的地改變核苷酸序列或特定的氨基酸，從而研究基因與蛋白質的結構和功能之間的關系。李兆豐等[39]采用定點突變的方法將來源于G.thermoglueosidan的SBE的第349位甲硫氨酸(Met)分別突變成蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)，所得2株突變體產物酶活相比于野生淀粉分支酶活力都提高了60%。LIU等[40]發(fā)現來自G.thermoglucosidansSTB02的SBE中，丙氨酸310(Ala310)位于保守區(qū)域Ⅱ，當用其他多種氨基酸取代Ala310后，突變酶活性下降10%～25%，表明Ala310對于來自G.thermoglucosidansSTB02的SBE的催化活性至關重要。

此外，通過酶分子定點飽和突變可以構建高質量突變體文庫，對特定靶點進行組合突變，實現酶分子的定向進化。為促進嗜熱酸性α-淀粉酶基因在BacillussubtilisWB600中的高效分泌表達，袁林等[41]對信號肽Yfk N的2個氨基酸位點進行飽和突變，得到的重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力為出發(fā)菌株的1.33倍。本實驗室基于序列比對及前期隨機突變結果，對SBE基因進行定點飽和突變，SBE酶活性較出發(fā)菌株提高30%。

3.3 優(yōu)化信號肽

將所需靶蛋白分泌到培養(yǎng)基中的第一步是跨細胞膜轉運，可細胞膜轉移的蛋白質通常具有N-末端信號肽，包含3個不同的區(qū)域：帶正電的N-末端結構域、疏水性核心區(qū)域和帶負電荷的C-末端區(qū)域(具有信號肽酶切割位點)[42]。將蛋白質遞送到正確的位置后，信號肽被信號肽酶降解。在細菌中，普通分泌途徑是從細胞質中輸出蛋白質最重要的方式[43]，在許多細菌中還存在雙精氨酸途徑[44]。信號肽的性質顯著影響宿主培養(yǎng)上清中蛋白的最終產量，因此，為靶蛋白尋找最佳信號肽是有效分泌生產過程中最關鍵的步驟之一。但目前尚無法預測在特定表達宿主中，哪個信號肽將最適合特定靶蛋白的表達[45]。

如YAO等[46]研究中，通過篩選173種枯草芽孢桿菌信號肽獲得α-淀粉酶最佳信號肽SP YojL，所得重組菌株產生的細胞外α-淀粉酶活性比對照高3.5倍。WATANABE等[47]以谷氨酸棒桿菌為宿主，異源表達來自嗜熱芽孢桿菌的α-淀粉酶，在405種候選信號肽中發(fā)現CGR0949信號肽可獲得最高的α-淀粉酶產量。

經驗和證據表明，異源蛋白質的分泌效率與信號肽高度相關，盡管具體的設計規(guī)則仍然難以捉摸，優(yōu)化信號肽的方法仍有望提高其他酶在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中的表達量。繼續(xù)優(yōu)化信號肽這項工作將加快SBE等蛋白產品的工藝優(yōu)化，也是本實驗室對于SBE研究的工作計劃之一。

3.4 改進誘導方法與培養(yǎng)條件

液體發(fā)酵中的各種物理化學參數，如培養(yǎng)溫度、pH值、接種量、誘導時間、添加劑種類等，都會對SBE的產量產生巨大影響。通過優(yōu)化這些參數，可以提高SBE在枯草芽孢桿菌中的產量。

楊韻霏等[48]將來自地衣芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶基因克隆至枯草芽孢桿菌中異源表達，并研究得到最適誘導溫度為45 ℃，最適誘導劑濃度為1%，最適誘導時間為接種培養(yǎng)9 h后。王馳等[49]在B.subtilisWB600中表達SBE，通過兩階段溫度控制策略，胞外酶活力與單一溫度條件下的最高水平相比提高了1.4倍；在此基礎上添加體積分數0.05%的Tween-80，可將胞外酶活由47.1 U/mL進一步提高到65.8 U/mL。ZHANG等[50]為提高來自B.naganoensis的普魯蘭酶在B.subtilisWB600中表達的酶活性，從接種量、pH值等角度出發(fā)，優(yōu)化了重組枯草芽孢桿菌生產普魯蘭酶的最佳發(fā)酵條件，優(yōu)化后產物的酶活性比優(yōu)化前提高144%。改進誘導方法與培養(yǎng)條件的策略對于提高微生物蛋白酶產物表達量及表達活性具有一定的通用性，在淀粉加工用酶類產物的研究中均取得了良好的效果，是本實驗室正在進行的研究工作。

4 結論

我國淀粉年總產量達上千萬噸，廣泛應用于食品、制藥、造紙、化工等行業(yè)。盡管我國已躋身世界淀粉強國行列，但國內企業(yè)主要生產銷售傳統(tǒng)淀粉產品，具有較高附加值的淀粉品種少、產量低，與國際水平相比仍有較大的差距。使用SBE對淀粉進行改性是綜合利用淀粉的重要手段之一。

SBE的異源表達可通過多種表達宿主完成，其中大腸桿菌研究深入，背景清晰，且具有易于培養(yǎng)、成本低、操作簡單等優(yōu)勢，因而成為SBE原核表達的主要表達宿主；SBE在枯草芽孢桿菌中的重組表達也較為廣泛。大腸桿菌異源表達的SBE多存在于包涵體內，實現SBE的高效胞外分泌表達是其研究的重點之一?？莶荼磉_系統(tǒng)較傳統(tǒng)的大腸桿菌系統(tǒng)，研究尚不成熟，但它在活性蛋白分泌、下游處理簡化、安全性提高等方面則表現出顯著優(yōu)勢，由此決定其更適合應用于食品領域，具有較大的研究與應用潛力。實踐證明，枯草表達系統(tǒng)能成功表達的外源蛋白質種類繁多，表達產物能保持其理化性質和生物活性。另外，在枯草表達系統(tǒng)運用中，仍存在表達效率和穩(wěn)定性不佳等問題，因此，對表達效率、穩(wěn)定性、后期純化難度等的有效評價和優(yōu)化，仍是SBE異源表達研究中的重點。除了大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，其他細菌也被應用于SBE的異源表達，如地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。

在國外實現SBE商業(yè)化的背景下，國內針對SBE生產的研究仍處于起步階段，且大多基于國外的零散介紹和借鑒。創(chuàng)新的關鍵不僅在于企業(yè)自身的努力，還需要基礎研究的推動。作者所在團隊在現有理論的支持下，立足開發(fā)優(yōu)良宿主菌株和表達載體，同時挖掘不同微生物來源的高性能SBE編碼基因，結合體外酶分子定向進化及高效發(fā)酵生產工藝，不斷提高SBE的表達量及活性。隨著人們對蛋白質研究的日益深入，基因工程手段的逐漸完善，在微生物中異源表達SBE的技術會越來越成熟，成本逐漸降低，改性淀粉將擁有更加光明的應用前景。