劉南斌,許 艷,施寶民

劉南斌,許艷,施寶民, 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院普通外科 上海市 154000

0 引言

2018年全球癌癥統(tǒng)計顯示,在185個國家中胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是導(dǎo)致死亡的第七大惡性腫瘤[1].PC多起源于胰腺導(dǎo)管上皮細胞和腺泡細胞.患者早期無特異性癥狀,就診時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移,手術(shù)切除率低,預(yù)后極差.5年生存率低,約5%-10%[2].雖然研究眾多,卻收效甚微.

近期的許多研究表明[3],外泌體參與和調(diào)控了PC細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性,可能成為預(yù)防PC轉(zhuǎn)移的新靶點.本文將對目前的研究進展做一綜述.

1 外泌體研究背景

外泌體起源于溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體,可通過胞吐作用分泌至細胞間隙.早在1979年,Trams等[4]就首次使用“exosomes”描述源自正常細胞和腫瘤細胞質(zhì)膜的微囊泡.1983年,Johnstone等[5]在探索網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)現(xiàn)了外泌體,但沒有給予正式命名,直到1987年,他們在實驗中分離出外泌體并給予了正式命名.

外泌體含有大量的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì).外泌體中的蛋白質(zhì)按照功能可以分為兩類：一類具體參與外泌體的形成,另一類能表達細胞類型特異.外泌體中的核酸包括多種類型的RNA,如微小RNA(microRNA,miRNA)、環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA等,以及少量DNA.外泌體中的脂質(zhì)大多集中在膜表面,其類型豐富包括膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺,磷脂酰絲氨酸等(圖1)

外泌體廣泛參與到了各類腫瘤的轉(zhuǎn)移當中,例如Le等[6]報道乳腺癌中乳腺癌細胞源性外泌體中miR-200可改變癌細胞的基因表達；Chen等[7]報道肝細胞癌中MHCC97H細胞分泌的外泌體可介導(dǎo)上皮間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化；Umezu等[8]報道黑色素瘤細胞系的外泌體miR-135b可促進內(nèi)皮血管形成等.不同來源的外泌體在PC轉(zhuǎn)移過程中更是發(fā)揮了重要作用.

2 外泌體在PC轉(zhuǎn)移中作用的研究進展

2.1 破壞腫瘤細胞的緊密連接,促進轉(zhuǎn)移 緊密連接是相鄰細胞的細胞膜共同構(gòu)成的一種細胞連接復(fù)合物,緊密連接的存在有利于將兩個細胞連接在一起防止大分子穿過間隙.Panc02和Panc02-H7是兩株等基因但轉(zhuǎn)移潛能不同的胰腺導(dǎo)管細胞腺癌(pancreatic ductal cell adenocarcinoma,PDAC)細胞,后者的轉(zhuǎn)移潛能明顯高于前者.Yu等[9]將PKH 67標記的Panc02-H7源性外泌體與Panc02細胞共培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)Panc02細胞可吸收該外泌體,隨后他們利用細胞粘附實驗證明吸收該外泌體的Panc02細胞系粘附性明顯降低,說明Panc02-H7源性外泌體可破壞細胞之間的緊密連接,增加遷移.在膽管癌中也存在相似機制,酈錚錚等[10]研究表明,膽管癌細胞源性外泌體可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而使得內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1及CLDN5明顯下調(diào),導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞屏障破壞,促進膽管癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移(表1).上述研究表明,外泌體能破壞腫瘤細胞的緊密連接,促進轉(zhuǎn)移.但PC細胞源性外泌體(pancreatic cancer cell-derived exosomes,PC-EXOS)破壞腫瘤細胞間的緊密連接的機制尚不清楚,深入探索關(guān)鍵分子,有利于明確其轉(zhuǎn)移機制,為抑制轉(zhuǎn)移帶來可能.

2.2 增強PC細胞的侵襲力 外泌體可以在細胞之間介導(dǎo)信息傳遞,細胞間信息傳遞可以促使受體細胞的侵襲能力增強,有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移.

Wang等[11]報道低氧條件下,外泌體miR-301a可以通過PTEN/PI3Kg通路介導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化,促進PC細胞轉(zhuǎn)移能力的提高.Masamune等[12]報道PC-EXOS能在胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSC)中激活PI3K/Akt和MAP信號通路促進腫瘤的發(fā)展和侵襲力的增強.Li等[13]對PC患者血漿中外泌體提取、分離后發(fā)現(xiàn),PC-EXOS分泌的miR-222可直接調(diào)節(jié)p27,促進細胞的侵襲和增殖,還可通過抑制PPP2R2A的表達而激活A(yù)KT,從而誘導(dǎo)p27磷酸化和胞質(zhì)p27的表達,促進細胞的生存和轉(zhuǎn)移.Pessolano等[14]對體外PC模型中外泌體進行研究發(fā)現(xiàn),外泌體蛋白Annexin A1可以促進PC侵襲、遷移和新生血管形成.Zhang等[15]通過體外小鼠實驗證明,PC-EXOS可分泌蛋白Ling28B,并將其轉(zhuǎn)移到其他PC細胞,激活Ling28B/Let-7/HMGA2/PDGFB途徑將循環(huán)中的PSC聚集,最終導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移能力的提高(表2).

在第一個話題的語料中，戀愛架構(gòu)出現(xiàn)的次數(shù)非常引人注意，包含了“國家是個人”“國際關(guān)系是人際關(guān)系”“親密的國際關(guān)系是親密的人際關(guān)系”三個層次的隱喻。例如文中出現(xiàn)的約會(date)、訂婚(engagement)等表達。該架構(gòu)出現(xiàn)頻率之高反應(yīng)了報道對美俄關(guān)系的重視。此外與之相反的戰(zhàn)爭架構(gòu)也出現(xiàn)了三次；對弈架構(gòu)出現(xiàn)了兩次，反應(yīng)了英國媒體視角下美俄兩國親密中又包含對立的關(guān)系，也透露將美國視為重要盟國的英國的微妙心態(tài)。

關(guān)于外泌體增強PC細胞侵襲力的研究已有很多,不同細胞源性外泌體增強腫瘤細胞侵襲力的方式不盡相同,具有復(fù)雜性.可以肯定外泌體能增強PC細胞的侵襲力,但外泌體內(nèi)部不同成分間是否會相互作用,從而影響外泌體對PC細胞的作用仍不清楚,需要進一步研究.

表1 破壞腫瘤細胞的緊密連接,促進轉(zhuǎn)移

表2 增強胰腺癌細胞的侵襲力

圖1 外泌體的結(jié)構(gòu)與成分.

2.3 促進腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞經(jīng)歷多種生化反應(yīng),轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細胞的過程.與上皮細胞相比,間充質(zhì)表型的細胞的運動能力更強,具有更強的細胞遷移力、侵襲力、對抗凋亡的抵抗力[16].

Kikuta等[17]將PC細胞與PC患者的胰腺組織中分離出的PSC在體外共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PSC的誘導(dǎo),PC細胞逐漸具有成纖維細胞樣外觀和疏松的細胞連接,說明PSC可促進PC細胞的EMT.Charrier等[18]利用小鼠模型實驗也證實該觀點,他們發(fā)現(xiàn)激活后的PSC可釋放富含miR-21的外泌體,作用于PC細胞,促進EMT.此外PCEXOS中包含了很多參與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控因子,如 Annexin A2等.Wu等[19]研究在PDAC中,旁分泌IL-6信號的Stat3/Nrf2途徑能促進PSC介導(dǎo)EMT相關(guān)基因表達,增強上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(表3).外泌體促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進其發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制較為明確.但是否所有細胞的來源的外泌體均可以促進PC細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,仍然需要進一步研究.

2.4 促進轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成 “轉(zhuǎn)移前生態(tài)位”一詞是用來描述在腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移前,在預(yù)轉(zhuǎn)移器官形成的有利于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境.PSC、成纖維細胞、肌成纖維細胞、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞和細胞外間質(zhì)都在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的構(gòu)成中發(fā)揮作用[20].

表3 促進腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

PC-EXOS可對擬轉(zhuǎn)移器官微環(huán)境中的間質(zhì)細胞進行改造并刺激血管再生,促進適宜腫瘤細胞遠處定植的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成.Nazarenko等[21]將富含Tspan8蛋白的PC-EXOS注入PC小鼠模型,分析小鼠PC細胞增殖、轉(zhuǎn)移行為后發(fā)現(xiàn),Tspan8蛋白可通過參與內(nèi)皮細胞活化通路,刺激原發(fā)部位的血管生成,進而促進原發(fā)部位腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移.Costa-Silva等[22]將PC細胞注射入實驗鼠脾內(nèi),通過觀察其肝臟的變化,證明肝庫普弗細胞可選擇性吸收PC細胞分泌的外泌體,誘導(dǎo)自身釋放轉(zhuǎn)化生長因子β,該因子促進肝星狀細胞產(chǎn)生纖維連接蛋白,有助于產(chǎn)生適合PC轉(zhuǎn)移的生態(tài)位.Rana等[23]研究指出,PCEXOS中miRNA和四天半胱氨酸也對轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成有調(diào)節(jié)作用.

此外,其他腫瘤細胞來源的外泌體在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成中也有類似作用.Chowdhury等[24]將前列腺癌細胞來源的外泌體與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),后者可分化為α-SMA陽性的肌成纖維細胞,該細胞既可促進血管生成又可增強腫瘤細胞侵襲能力,有助于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成(表4).

上述研究表明,外泌體可發(fā)揮信使作用,在遠隔器官形成適合腫瘤生長的“生態(tài)位”,促進其發(fā)生轉(zhuǎn)移.但其機制仍然不是很明確,不同細胞來源的外泌體是否都促進轉(zhuǎn)移前“生態(tài)位”的形成,仍然需要深度挖掘以明確.

2.5 影響腫瘤細胞的能量代謝 腫瘤細胞在許多方面不同于正常細胞,細胞代謝改變是腫瘤的特征之一.Zhao等[25]檢測PC組織中癌癥相關(guān)成纖維細胞源性外泌體(cancer-associated fibroblast-derived exosomes,CAFEXOS)內(nèi)容物后發(fā)現(xiàn),其含有氨基酸、脂類和三羧酸循環(huán)中間體在內(nèi)的完整的代謝物.通過13C標記實驗證實CAF-EXOS為缺乏營養(yǎng)的PC細胞提供能量的多種機制,包括破壞正常細胞的線粒體氧化代謝通路,為PC細胞提供現(xiàn)有代謝物質(zhì)等.Sousa等[26]發(fā)現(xiàn),PDAC在缺乏能量物質(zhì)時,可刺激腫瘤微環(huán)境中PSC發(fā)生自噬效應(yīng)并分泌丙氨酸,維持腫瘤代謝水平.

此外,單個腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體可給其他腫瘤細胞供能.Yan等[27]利用細胞實驗證明乳腺癌細胞胞外囊泡的miR-105,能在腫瘤微環(huán)境中傳遞至腫瘤相關(guān)成纖維細胞(tumor-associated fibroblast,CAF),誘導(dǎo) CAF 根據(jù)代謝水平的不同而表現(xiàn)出不同的代謝狀態(tài).Fong等[28]利用乳腺癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細胞所分泌的富含miR-122的外泌體可通過下調(diào)丙酮酸激酶活性而抑制非乳腺癌細胞對葡萄糖的攝取(表5).

外泌體影響腫瘤細胞的能量代謝研究成果較少,現(xiàn)有的研究對其具體作用途徑不甚明了.正常細胞發(fā)生癌變以后,其能量代謝本身也會發(fā)生變化,外泌體及其成分如何參與到這一過程,發(fā)揮了什么樣的作用,仍然需要進一步闡明.

2.6 抑制宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致免疫逃逸 Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn),PC-EXOS可釋放miR-203下調(diào)樹突狀細胞中TLR4受體的表達,并抑制TNF-a、IL-12等因子的分泌,從而干擾正常的免疫應(yīng)答.Javeed等[30]將PC-EXOS導(dǎo)入CD14單核細胞后發(fā)現(xiàn),PC-EXOS可通過調(diào)節(jié)STAT3信號通路,將正常單核細胞轉(zhuǎn)化為具有免疫抑制作用的單核細胞.Whiteside等[31]研究發(fā)現(xiàn),包括PC在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤源性外泌體都可以通過調(diào)控T細胞和NK細胞的活性,活化TCR信號通路而抑制免疫反應(yīng).巨噬細胞有M1和M2兩種亞型,M1型促進炎癥反應(yīng),M2型抑制炎癥反應(yīng)；Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn),在PC組織侵襲邊界巨噬細胞多為M2型,有利于減弱免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的吞噬作用(表6).

外泌體對免疫功能的調(diào)控具有復(fù)雜性.根據(jù)外泌體來源、內(nèi)部成分、靶向細胞的不同,可發(fā)揮完全相反的作用.外泌體內(nèi)部成分之間、外泌體與PC細胞之間均存在復(fù)雜的相互作用,需要深入研究,以明確其機制.

外泌體及其某些結(jié)構(gòu)或者成分,可能通過以下通路對PC的轉(zhuǎn)移和侵襲能力進行調(diào)控.據(jù)推測,不同通路之間會有所交叉,不會孤立性發(fā)揮作用,各種通路之間是不是是聯(lián)合或者序貫發(fā)揮作用,有待于進一步研究證實(圖2).

3 結(jié)論

外泌體自發(fā)現(xiàn)以來備受關(guān)注,已證實在PC轉(zhuǎn)移等方面

發(fā)揮重要作用.但還有很多問題亟待解決：(1)對不同細胞外泌體分泌機制及其調(diào)控因素尚不甚明了；(2)外泌體內(nèi)部發(fā)揮調(diào)控作用的具體結(jié)構(gòu)或者成分亦有待于進一步研究；(3)多種機制或者途徑中間,到底是聯(lián)合、還是序貫發(fā)揮作用,仍需要進一步證實；(4)目前研究僅局限于細胞或動物模型中,距離臨床應(yīng)用研究還有待時日.另外,從技術(shù)角度看,盡管已經(jīng)趨向成熟,但外泌體制備和提純等相關(guān)實驗技術(shù)還不能滿足更廣泛、更深入的研究.相信不久的將來,外泌體及結(jié)構(gòu)成分可能會對PC的治療研究揭開新的篇章.

表4 促進轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成

表6 抑制宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致免疫逃逸

圖2 外泌體在胰腺癌轉(zhuǎn)移中作用途徑示意圖.